文|易霄寒

编辑|易霄寒

前言

玉米是我国重要的粮食、饲料和能源作物，保证玉米高产稳产，对保证国家粮食安全、人民增收起着重要的作用。

但我国玉米主产区，大部分存在着水资源严重不足、蒸发量大、水分流失快等问题，据统计，我国每年因干旱造成玉米受灾面积达4.58×106hm2，导致玉米减收约2.6×106t，干旱已成为玉米产量下降、品质降低的最严重的自然灾害之一。

烯醇化酶又称为2-磷酸-D-甘油酸盐水解酶，它属于一种金属酶，在细菌、真菌、动植物中广泛存在，在生物发酵代谢途径，尤其是糖酵解途径中扮演着重要的角色。

烯醇化酶在植物中的生物学功能，得到了大量研究学者的关注，但是玉米烯醇化酶基因ENO1，响应干旱、高温胁迫相关的研究报道甚少。

因此，本研究在前期实验中，筛选到积极响应干旱胁迫的玉米烯醇化酶基因ZmENO1，对其进行克隆和遗传转化分析，证实其具有正向调控拟南芥的抗旱性和耐高温能力。

并通过酵母双杂交实验初探其互作网络，为探究ZmENO1的生物学功能奠定基础，为抗旱、耐高温分子育种储备优良基因资源和分子育种，提供新的方法和思路，加速抗旱、耐高温突破性品种培育的进程。

试验材料及处理

经过多年多点表型鉴定，筛选出2种不同的基因型自交系：抗旱型玉自交系（NK11，M）和干旱敏感玉米自交系（B73，F）。

本文以NK11和B73为试验材料开展研究，挑选颗粒饱满、大小一致的NK11和B73玉米籽粒，播种在营养土中，待其长至三叶一心时，同时转移至霍格兰营养液中进行水培。

2d后进行正常干旱（质量分数20%PEG6000）和高温（37℃）处理，在处理0、12、24、36、48、60、72、84、96h时取根、茎和叶，用于提取RNA，每个部位取3个生物学重复。

实验所需要的拟南芥种子，要经4°C处理3d后，再播种到营养土中，待其长出4片叶时进行移栽，2周后暂停浇水，处理6d后取样，进行生理指标的测定和相关基因表达量的测定。

对于酵母双杂交实验的操作过程如下：

首先对ZmENO1基因进行自激活检测，将玉米cDNA文库，转化到含有重组质粒pGBKT7-ZmENO1的Y2HGold酵母感受态中，将菌液涂布于缺陷型SD-Trp/-Leu/-His培养基上，28°C倒置培养4d。

再挑取长势较好的菌斑，用水稀释后点在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基上，28°C培养，筛选蓝色阳性菌斑，用于菌液PCR，PCR，产物送测序公司测序，利用NCBI数据库，对其进行同源性比对分析，筛选相关的基因。

荧光定量的分析操作及结果

使用Trizol提取样品的总RNA，并反转录为第一链cDNA作为模板，设计特异性引物进行实验，再根据2−∆∆Ct法，计算基因的相对表达量，每个样品重复3次。

荧光定量结果显示，干旱胁迫下ZmENO1在抗旱自交系NK11（M）根、茎和叶中的表达量，要始终大于干旱敏感自交系B73（F）相同组织中的表达量。

根据荧光定量显示，在干旱胁迫处理48h时，NK11中ZmENO1的表达量与B73中ZmENO1的表达量，相差倍数达到最大，为4.72倍；茎部位同样在处理48h差异倍数达到最大，为7.32倍，叶部位则在处理72h时差异倍数达到最大，为4.34倍。

结果暗示，ZmENO1的表达量高低与材料的抗旱性强弱有紧密联系。

对NK11中ZmENO1对干旱胁迫的响应进行进一步的分析，结果显示，ZmENO1对干旱胁迫积极响应，受到干旱胁迫的诱导表达，在处理60h时表达量达到最大，为10.58。

并且，干旱胁迫下ZmENO1的表达量，与对照组中ZmENO1的表达量之间，具有显著性差异。

结果表明ZmENO1积极参与了玉米对干旱胁迫的响应。

干旱、高温胁迫下ZmENO1转基因拟南芥株系表型分析

我们首先对ZmENO1进行遗传转化，用荧光定量方法筛选阳性拟南芥株系，野生型拟南芥株系中，未检测到ZmENO1基因的表达，转基因株系L-1和L-2中ZmE-NO1高表达，证明获得了过表达ZmENO1拟南芥植株。

正常生长条件下，野生型与ZmENO1过表达植株的长势一致，干旱胁迫处理14d后，野生型植株严重失水，出现萎蔫现象，ZmENO1过表达植株长势明显比野生型好。

但高温处理4d时，各株系均出现了较严重的萎蔫现象，但相对于野生型植株，ZmENO1过表达植株的萎蔫程度相对较轻。

从表型结果来看，过表达ZmENO1后，增强了拟南芥抗旱性和耐高温能力。

接下来测定胁迫处理前后，拟南芥植株的叶绿素含量、渗透调节物质脯氨酸含量SOD和POD活性。

正常生长条件下，各指标在野生型植株和ZmENO1过表达植株中无差异。

胁迫处理后，叶绿素含量均出现了明显的下降，且旱胁迫和高温处理下，野生型拟南芥植株的叶绿素含量相对于转基因植株显著性较低。

脯氨酸含量在处理前各株系间无差异，干旱胁迫处理后，过表达株系中的脯氨酸含量，是野生型株系中脯氨酸含量的1.86~1.92倍，高温处理后，过表达株系中的脯氨酸含量，是野生型株系中脯氨酸含量的1.92~2.01倍。

我们得出，SOD活性在胁迫处理后明显增加。

旱胁迫后，转基因株系SOD活性比野生型拟南芥分别高了21.30%、19.20%，高温胁迫下，转基因株系SOD活性比野生型拟南芥分别高了16.55%、22.30%。

同SOD活性一样，各株系中POD活性在处理前无差异，胁迫后POD活性明显升高。

旱胁迫后，转基因株系POD活性比野生型拟南芥分别高了37.44%、40.97%。高温胁迫下，转基因株系POD活性比野生型拟南芥分别高了29.95%、31.68%。

就生理指标来看，过表达ZmENO1后，降低了干旱、高温胁迫对拟南芥叶绿体的破坏，并通过提高脯氨酸含量，来平衡渗透势，和通过提高抗氧化酶SOD和POD活性，来保护细胞膜，这或许是增强拟南芥抗旱性和耐高温能力的原因之一。

抗氧化酶和渗透调节相关基因的表达分析

荧光定量结果显示，ZmENO1过表达植株中的抗氧化酶系统，其中的的关键基因AtSOD1、AtPOD1及脯氨酸合成关键基因AtP5CS1，都受到干旱、高温胁迫的诱导上调表达。

干旱胁迫下，过表达植株中AtSOD1、AtPOD1和AtP5CS1的表达量是野生型植株的2.50、2.76和1.96倍。

高温胁迫下，过表达植株中AtSOD1、AtPOD1和AtP5CS1的表达量是野生型植株的4.33、3.14和1.77倍。

干旱、高温胁迫下，ZmENO1过表达植株中的抗氧化酶基因，和渗透调节物质脯氨酸，合成的关键基因表达量，显著高于野生型，该结果与所测的生理指标相吻合。

这进一步说明，ZmENO1可通过提高干旱、高温胁迫下渗透调节物质脯氨酸含量，和抗氧化酶活性，来增强拟南芥抗旱性和耐高温能力。

在干旱胁迫下，非生物胁迫相关基因AtCOR15A、AtDREB2A和AtADH1基因的表达量相对于对照组，均出现升高现象，但是基因表达量在转基因株系和野生型株系中无差异。

AtABA2和AtRD17的表达量受到了干旱胁迫的诱导表达，且转基因株系的表达量，要显著高于野生型中的表达量，分别达到了6.27和3.02倍。

野生型拟南芥植株的AtRD29A表达量，在干旱胁迫下降低，转基因株系中的表达量则升高，AtRD29A在转基因株系与野生型植株中的表达量达到了6.72。

AtDREB2A、AtADH1和AtABA2的表达受到高温胁迫的诱导，转基因株系中AtDREB2A和AtADH1的表达量，显著性高于野生型植株照中的表达量，而在高温处理下，转基因株系中AtABA2的表达量，要显著性低于野生型植株中的表达量。

AtCOR15A、AtRD17和AtRD29A的表达则受到高温胁迫的抑制，高温胁迫下，转基因株系和野生型株系中AtCOR15A的表达量无差异，转基因株系中AtRD17和AtRD29A的表达量，则显著低于野生型中的表达量。

综上分析，推测ZmENO1的过表达拟南芥株系，可能通过ABA依赖路径，稳定细胞膜渗透势及增强抗氧化酶活性，从而提高了拟南芥对干旱胁迫的耐受力。

而ZmENO1可能通过非依赖ABA路径，提高了过表达拟南芥株系的耐高温能力。

最后我们进行对ZmENO1互作蛋白的筛选。

对SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养基上培养的蓝色阳性菌斑，进行PCR检测，最后将48个PCR产物送测序公司测序。

序列信息通过NCBI玉米数据库比对分析，筛选到8个与ZmENO1存在互作关系的蛋白，分别是Zm00001d038163、Zm00001d003750、Zm00001d016731、Zm0000-1d013911、Zm00001d002454、Zm00001d030688、Zm00001d045056、Zm00001d053861。

讨论

玉米的安全生产对于我国的粮食安全起着关键的作用，但干旱、高温严重影响玉米的产量和品质，所以耐高温种质创制，是当下玉米抗旱、耐高温育种的迫切任务。

烯醇化酶在糖酵解途径中扮演着重要的角色，影响着植株的生长发育，在植物响应盐胁迫和冷胁迫的研究中被多次报道。

目前对于烯醇化酶的研究多集中在模式生物中，玉米中烯醇化酶的研究较少，烯醇化酶在干旱、高温中的研究更少。

本研究中，非ABA依赖型基因AtCOR15A、AtDREB2A和AtADH1，受到干旱胁迫诱导上调表达，但在ZmENO1过表达株系中和野生型植株中的表达量无差异，ZmENO1过表达株系中ABA依赖型基因AtABA2、AtRD17和AtRD29A的表达量，则显著高于野生型植株中的表达量。