前言：

当拉曼光谱（RS）与样品相互作用时，样品中的分子将吸收光子并发生振动和旋转改变光的能量，导致拉曼散射光的频率发生变化，提供关于样品中分子的化学键、分子结构和相互作用等信息。

经过我们研究发现，RS能够100%准确地区分茎腐病和盐度胁迫，并预测这两种胁迫在植物早期和晚期的存在。

植物和真菌材料：

在MetroMix4RSi土壤中种植B73玉米基因型种子，每盆种植6-360粒种子，种子发芽后，每盆保留一株玉米幼苗，在接下来的两周内进行减薄。

玉米每3-4天浇水一次，并在种植后的大约20周和19周时向每个盆施用5克OsmocoteBlend9-1-001缓释肥料，孢子悬浮液的制备与之前描述的相同，接种时间点为植物丝化的50%（中期丝化）。

在最后一个带有支撑根的节点上方的底部四个节间，使用插入18/1英寸深度的4G皮下注射针刺伤，将无菌棉签浸入1×10孢子悬浮液中，浓度为6孢子/mL的C.graminicola，并用封口膜包裹在伤口处形成潮湿的腔室。

感染允许在选定的时间点2、4、6和8dpi进行进展，每个处理组总共分析了10株植物，同时对73株B150植物进行盐胁迫，每株植物用10mM氯化钠浇水以诱导盐胁迫，最后对10株植物进行盐胁迫并接种G.graminicola，而另外10株未经处理的植物作为对照组。

在同样的实验条件下，我们通过将玉米秸秆接种C.graminicola来模拟玉米秸秆腐病，这是第一组植物的处理方式。

第二组植物则通过使用150mM氯化钠浇灌来模拟盐胁迫，最后的第三组植物同时暴露于盐胁迫和C.graminicola感染，我们还种植了一组玉米作为对照组，这些玉米在相同的实验条件下没有受到任何胁迫。

拉曼光谱：

使用配备2nm激光源的手持式Resolve安捷伦光谱仪，我们从第4和第830节间表面收集了拉曼光谱。

在所有的光谱收集过程中，我们使用了以下实验参数，1秒的积分时间，495mW的功率，并使用设备软件进行基线光谱减法，从每组植物中共收集了50个光谱，需要注意的是，手稿中显示的光谱是经过原始基线校正的，没有进行平滑处理。

光谱数据分析：

数据预处理是数据分析中的关键初始步骤，其主要目的是在光谱采集过程中消除或最小化多种信号噪声源对光谱数据质量的影响，这些噪声源包括样品背景和仪器性能等因素，可能导致光谱数据质量的下降。

通过光谱预处理，我们可以消除或减少这些影响，以增强后续的多元回归、分类模型或探索性分析的可靠性和准确性。

本研究采用了标准正态变量（SNV）作为光谱分析的预处理方法，SNV方法通常被认为是一种散射校正方法，其目的是减少由散射引起的样品之间的物理变异性，或者用于调整样品之间的基线偏移。

通过应用SNV预处理，我们可以更好地纠正光谱数据中的散射效应，并提高后续分析的准确性和可靠性。

机器学习模型：

在这项工作中，我们采用了偏最小二乘判别分析（PLS-DA）方法，PLS-DA是主成分分析的监督版本，它利用目标变量的信息来进行降维，并通过权重和载荷提供对判别原因的深入理解，从而有助于进行探索性数据分析。

在本研究中，我们对800个样本进行了PLS-DA分析，并将其分为校准集和验证集两组，所有的计算和数据分析都是在MATLAB2022b环境下进行的。

结果和讨论:

在从健康玉米秸秆获得的拉曼光谱中，我们观察到了一些显著的振动带，可以归因于苯丙烷类化合物（1601-1627cm−1）的存在，并且在光谱中起主导作用。

我们还观察到了一些与果胶（742cm−1）、纤维素（520、915、1040、1093和1121cm−1）、类胡萝卜素（1525cm−1）、羧酸（1698cm−1）和脂肪族振动（1326、1335、1424和1460cm−1）相关的振动带。

在第2天从受C.graminicola感染的玉米秸秆获得的拉曼光谱中，我们观察到了与健康玉米的光谱类似的振动带，但与健康玉米相比，大多数振动带的强度稍微下降。

这些结果表明，真菌感染导致植物的生物化学发生了显著变化，这些变化可以通过拉曼光谱进行检测，当我们观察受盐胁迫和秸秆腐病同时作用的玉米的光谱时，我们发现上述振动带的变化幅度更大。

具体来说，我们观察到苯丙烷、纤维素和木质素振动的强度显著降低，除此之外，我们还注意到与在健康植物和受C.graminicola感染的玉米中观察到的光谱相比，暴露于盐胁迫和秸秆腐病的植物中果胶和碳水化合物振动带的强度增加。

这表明，玉米对这两种生物（C.graminicola）和盐胁迫的反应是不同的，当在应力开始后的第8天对相同植物的光谱进行分析时，我们观察到振动带的强度变化与第2天观察到的类似，说明由这些胁迫引起的植物生物化学变化随时间的推移而持续存在。

接下来，我们使用了化学计量学方法PLS-DA，以定量评估获得的拉曼光谱之间的差异。

PLS-DA模型结合SNV预处理可以准确区分对照组、盐度胁迫组和C.graminicola感染组之间的差异，以及在连续暴露于C.graminicola和盐胁迫的植物中，包括第100、2、4和6天的8%准确率。

作物产量受到多种因素的决定，包括植物遗传、灌溉和土壤条件等。此外，各种植物病害（如真菌和病毒感染）可导致作物产量降低多达30%。

胶孢菌是一种感染玉米秸秆的真菌，可导致5-20%的玉米产量损失，我们预期可以利用秸秆腐烂的确诊来实现针对杀菌剂的特定位点和剂量应用，从而实现更有效的病害控制和最大化玉米产量。

PCR和ELISA等分子技术可用于检测真菌病害，具有高度的特异性和敏感性，但PCR和ELISA的操作耗时且需要人力，限制了农民和植物病理学家广泛使用这些分子分析方法。

越来越多的证据表明，红绿蓝（RGB）成像、高光谱成像和热成像等成像技术可以克服这些限制，虽然这些成像技术所需设备昂贵，但直接成本非常低。

但可惜的是成像技术缺乏特异性，因为植物病害的识别主要基于叶片颜色的变化，同时许多生物和非生物因素，如干旱和缺氮，也会导致植物质地和颜色的视觉变化，与上文描述的生物胁迫相似。

分子和成像技术的这些局限性促使人们寻找用于验证植物对生物和非生物胁迫的替代技术。

我们的实验结果表明，拉曼光谱可以以确认性、非侵入性和非破坏性的方式监测植物的健康状况，我们成功地利用拉曼光谱对柑橘绿化病进行诊断，并在橙子和葡萄柚中实现了近100%的准确率。

结果还表明，拉曼光谱可以区分柑橘绿化病和导致植物叶片呈现相似黄色的营养缺乏。

我们的实验进一步证明，拉曼光谱能够区分水稻中的多种生物胁迫和非生物胁迫，通过对植物光谱的分析，我们观察到了源自类胡萝卜素的振动带的强烈强度。

我们还使用高效液相色谱（HPLC）对植物中的类胡萝卜素进行了分析，以验证通过拉曼光谱观察到的类胡萝卜素浓度变化确实存在于植物中。

结果显示，健康植物以及受到生物和非生物胁迫感染的植物中，拉曼光谱感应和HPLC测定的类胡萝卜素水平之间存在着良好的相关性。

我们发现拉曼光谱（RS）可以用于确定不同玉米品种对C.graminicola真菌的抗性程度，为了验证这一点，将病变的大小与振动带强度的变化，即类胡萝卜素、苯丙烷和纤维素的振动带强度，进行了关联分析。

观察到不同品种的玉米，尤其是B73、lox4-7和MP305，在感染C.graminicola后呈现出略微不同的光谱变化，这些结果表明，拉曼光谱可以在遗传改良计划的选择过程中发挥作用。

通过RS技术，我们可以评估不同玉米品种对C.graminicola的抗性，从而为选育更耐病的玉米品种提供有力的支持。

结论:

我们的研究结果表明，拉曼光谱（RS）可以以100%准确度区分同一作物中的生物胁迫（如茎腐病）和非生物胁迫（如盐度），RS还可用于检测玉米中这两种胁迫的存在，并将这种生物-非生物胁迫组合与单独的生物或非生物胁迫区分开来。

实验进一步证明，RS可以区分不同的非生物胁迫，如干旱和缺氮。

我们通过对小麦叶片类胡萝卜素谱进行基于高效液相色谱法（HPLC）的分析，发现基于拉曼光谱的不同生物和非生物胁迫的区分是基于对类胡萝卜素化学特征的感知，而这些特征在不同的生物和非生物胁迫下是独一无二的。

尽管目前的研究主要集中在验证基于拉曼光谱区分干旱和茎腐病的可行性以及诊断玉米中的双重胁迫，但研究结果表明，RS可用于区分玉米中不同的生物和非生物胁迫。

参考文献

【1】杰克逊-齐姆斯，《玉米的常见茎腐病》

【2】古普塔，《携式拉曼叶夹传感器，用于快速检测植物胁迫》

【3】莫雷，《基于拉曼光谱的两种花生种质缺水和盐度应力诊断》

【4】高晓辉，《.玉米9-脂氧合酶的破坏可增加对真菌病原体的抗性，并降低霉菌毒素伏马菌素的污染水平》