文丨木木科普官

编辑丨木木科普官

在植物中，已从基因组已完全测序和注释的84个物种中，鉴定出19个假定的TF家族和其他转录调节因子植物转录因子数据库，TF是以其序列特异性方式与其靶启动子中的顺式元件结合的蛋白质，而TRs通过蛋白质-蛋白质相互作用或染色质重塑发挥其调节功能。

在酵母中，除了Pol III之外，RNAPIII转录复合物还需要三种转录因子：两种通用转录因子TFIIIB和TFIIIC，以及一种特定的转录因子TFIIIA，它仅用于合成5S rRNA。

Maf1是酵母中RNAPIII转录系统中的主调节因子，这对于在不断变化的营养，环境和细胞应激条件下调节转录至关重要。Nhp6是酵母染色质结构的另一种小而强大的效应子，具有在高温下促进RNAPIII转录的功能。

植物生长条件，玉米自交系A619种子最初是从玉米遗传学合作存量中心获得的，并于2017年夏天在我们位于上海的研究所农场种植。烟草植物在16/8小时的昼/夜条件下在20-25°C的温度下生长。

RNA制备、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和PLATZ基因克隆

在播种后32天从至少三株健康植物中收集组织，在授粉后1、3、6、8、10、12、14、18、24和30天收获发育中的籽粒。使用TRIzol试剂从新鲜组织中提取总RNA，然后用RNeasy迷你试剂盒纯化。

第一链cDNA按照手动说明使用SuperScript III逆转录酶合成。每个ZmPLATZ基因的完整开放阅读框用特定的引物对扩增。用于RT-PCR的所有引物列在附加文件中。以玉米GRMZM2G105019为参考。

从叶、茎、流苏、胚乳或胚胎组织中扩增了1个ZmPLATZ cDNA，但ZmPLATZ8和ZmPLATZ1除外。

PLATZ蛋白的亚细胞定位

使用从ZmPLATZ CDS翻译的氨基酸序列使用wolf-psort或PredictNLS在线工具预测核定位信号。将每个ZmPLATZ CDS的C端融合到编码增强GFP的报告基因上，然后将其克隆到由1301S启动子驱动的pCAMBIA35质粒中。

使用无针注射器，将含有该结构的根癌农杆菌浸润到3周龄的本氏猪笼草叶中，至少进行了三次重复。使用共聚焦显微镜观察和成像eGFP信号。

酵母双杂交测定，将PLATZ的全长编码序列克隆到pGBKT7质粒中，并转化为酵母菌株Y2HGold以测试自动激活。SD / - Trp琼脂平板上的酵母在28°C下生长2天，在SD / - Trp -Ade -He上生长3天。

对于蛋白质-蛋白质相互作用测定，将TFC1和RPC53连接到pGADT7质粒上。pGADT7-TFC1或pGADT7-RPC53与pGBKT7-PLATZs共转化成Y2HGold，将酵母细胞在28°C的SD / - Trp -Leu上接种2天，在SD / - Trp -Leu -Ade-He上接种3天。

玉米基因组中ZmPLATZ的鉴定

在PlantTFDB和GrassTFDB数据库中检索了玉米PLATZ蛋白，这两个数据库都基于B73基因组版本。这次检索从两个数据库中确定了21个和15个成员。尽管表征了26个完全独特的蛋白质序列，但只有15个PLATZ被公开的玉米RNA-seq数据确认为表达基因。

蛋白质命名法与GrassTFDB ID一致，版本16注释的两个新PLATZ被命名为ZmPLATZ17和ZmPLATZ1。7个ZmPLATZ基因不均匀分布在1条染色体上。

ZmPLATZ的系统发育分析

11个PLATZs，即7，15和5，在除发育中的胚乳外的所有组织中均表现出高且普遍的表达。如RT-PCR所示，PLATZ3在所有测试组织中以不同水平表达。

但不在公开的RNA-seq数据中。PLATZ13和PLATZ3在根、茎、叶、SAM和早期种子中表现出相似的表达模式，但PLATZ6的表达水平较高。 PLATZ9基因在流苏中特异性表达，说明该基因的功能参与流苏发育，PLATZ4转录本仅在根和茎中检测到。

发育中的胚乳中PLATZ4的转录水平远高于其他组织中的转录水平。然而，PLATZ3比Fl12更普遍地表达，后者仅在胚乳中检测到高水平的表达，而在胚胎中检测到弱水平的表达。

另外两个PLATZs，在胚乳中表达10至10 DAP，与胚乳填充的开始相吻合，PLATZ8在1 DAP的胚乳中弱但特异性表达。

根据其表达水平和模式，玉米PLATZ基因可分为两类，Fl3因其在胚乳中最高和特异性表达而作为外组分支出现。第一类由4个基因组成，表达水平高且更普遍，表明在植物生长发育中具有综合作用。

第二类包括表达水平相对较低且特异性的其他PLATZs。ZmPLATZ17和ZmPLATZ73由于在B3基因组版本中缺失而未包含在两个集群中的任何一个中。

ZmPLATZs和RNAPIII的蛋白质-蛋白质相互作用

先前，FL3与RNAPIII亚基RPC53和TFC1具有蛋白质-蛋白质相互作用，但使用酵母反式活化试验未发现该蛋白质没有内在活化特性。然后，我们研究其他融合的BD-ZmPLATZ蛋白是否能够与GAL4上游激活序列结合并激活lacZ报告基因的转录。

与不透明对照相反，没有PLATZ表现出内在活化特性，因此，ZmPLATZs可用于验证蛋白质-蛋白质与酵母双杂交的相互作用。

玉米、水稻和拟南芥中PLATZ蛋白的系统发育分析，从玉米基因组中鉴定了17个ZmPLATZ。为了探索PLATZ蛋白在其他物种中的进化保守性，在水稻和拟南芥数据库中分别鉴定出15个和12个独特的蛋白质序列。为了研究PLATZ蛋白之间的系统发育关系。

我们构建了17个ZmPLATZs，15个OsPLATZs和12个AtPLATZ的系统发育树。采用最大似然法构建系统发育树，使用Clustal W和MEGA 7.0构建系统发育树。

将44种PLATZ蛋白分为5个亚家族，根据主要氨基酸序列命名为I，II，III，IV和V。我们注意到每个亚科包括玉米，水稻和拟南芥成员。亚科I对应于ZmPLATZs系统发育树的分支1，并包含一个保守结构域在N端。

一些ZmPLATZ成员具有具有高自举支持的OsPLATZ同系物，例如ZmPLATZ9和LOC Os02g09070，ZmPLATZ16和LOC Os06g41930，以及ZmPLATZ6和LOC Os02g44260，表明这些成员在草科中进化上是保守的。

一些ZmPLATZ成员有两个OsPLATZ同系物，如LOC Os01g33350和LOC Os01g33370与ZmPLATZ12和LOC Os08g44620和LOC Os11g24130与ZmPLATZ4。

LOC Os01g33350和LOC Os01g33370的基因组位置接近，表达模式相似，表明两个OsPLATZ基因是玉米和水稻物种形成分裂后基因重复的结果。

PLATZ蛋白属于与RNAPIII相互作用的新型TF家族

在玉米B73基因组版本3和4中PLATZ蛋白的全基因组筛选中，我们确定了17个完整的成员，它们都拥有保守的PLATZ结构域。在成员中，15个ZmPLATZ的表达在变异组织中得到证实。

人工合成了ZmPLATZ1和ZmPLATZ8的编码序列，用于后续研究，所有ZmPLATZ蛋白都位于细胞核上。基于随机结合位点选择RBSS实验， 通过FL3识别富A/T序列。

除ZmPLATZ2，ZmPLATZ6和ZmPLATZ8外，所有成员都与RPC53或TFC1或两者发生蛋白质 - 蛋白质相互作用，这一发现表明ZmPLATZ蛋白通常参与RNAPIII转录的调节。

尽管功能获得突变体fl3，在胚乳发育和储存储备填充方面表现出严重缺陷，但该基因的敲除和敲低突变不会引起明显的粉状表型。除FL3外，ZmPLATZ2、ZmPLATZ4、ZmPLATZ10和ZmPLATZ14也在发育的胚乳中。

ZmPLATZ4与TFC1相互作用，ZmPLATZ10/14与RPC53和TFC1相互作用。人们可以设想，三个RNAPIII相互作用的ZmPLATZ与玉米胚乳中的FL3具有冗余功能。

因此，创建一系列ZmPLATZ4，ZmPLATZ10，Fl3和ZmPLATZ14的双，三和四突变体将是克服功能冗余的有效方法。

植物特异性PLATZ家族的分类和系统发育分析

在水稻和拟南芥中鉴定出相当数量的PLATZ基因，尽管玉米基因组大小比水稻和拟南芥大~430.26倍和~125.27倍。这种巨大的差异可以用玉米基因组中转座子的比例高得多来解释，PLATZ基因的数量在不同的植物基因组中显然是保守的。

对玉米、水稻和拟南芥进行了PLATZ蛋白的系统发育比较，首次研究了它们在不同物种内部和之间的进化关系。由于ZmPLATZ和AtPLATZ之间的身份较低，一些外部节点的自举值较低;尽管如此，内部节点具有更可信的引导值。

来自玉米、水稻和拟南芥的44个PLATZ成员被分为5个亚科。由17个ZmPLATZ蛋白构建的ML系统发育树可分为2个分支，与ZmPLATZs系统发育树分支对应的总ML树的亚科I包含一个保守结构域在 N 端。

同时，两棵树之间的内部节点具有可比性。例如，玉米ML树中ZmPLATZ12和ZmPLATZ4的分支也包含在总ML树的亚科III中，玉米ML树中ZmPLATZ2和ZmPLATZ14的分支被包括在总ML树的亚科V中。

此外，亚科III包括LOC Os01g33350、LOC Os01g33370和ZmPLATZ12，它们在水稻和玉米胚乳发育过程中表现出相似的表达模式，表明直系同源PLATZ成员在草中的保守功能。

结论

调节植物RNAPIII转录的成分和机制知之甚少。来自柑橘的CsMAF1是植物中第一个表征的RNAPIII相互作用蛋白，可以与人类RNAPIII相互作用并抑制tRNA他酵母中的合成，表明MAF1蛋白的功能在不同的王国中进化保守。

另一个例子是UBL1，一种假定的RNA核酸外切酶，属于2H磷酸二酯酶超家族，其在体外具有RNA核酸外切酶活性，并参与snRNA U6的生物发生。UBL1的结构和功能在植物、人类和酵母中是保守的，尽管植物UBL1分别仅与人类和酵母的25.8%和20.6%相同。

玉米等草的籽粒灌浆是淀粉和储存蛋白合成和积累的高能耗过程，需要对核糖体和蛋白质合成进行准确协调的调控。FL3在玉米胚乳淀粉细胞中特异性表达，并作为RNAPIII转录复合物的调节剂，与玉米胚乳中tRNA和5S rRNA的高丰度合成一致。

PLATZ的全基因组鉴定和表征以及它们与玉米RNAPIII相互作用的分析，将为了解植物发育中每个PLATZ成员的共同和特定特征提供途径。

我们在玉米基因组中鉴定并克隆了17个PLATZ基因，发现53个PLATZ与RPC1和TFC相互作用。研究结果表明，ZmPLATZ蛋白通常参与RNAPIII介导的小非编码RNA转录的调节。

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