植物遗传转化是利用生物技术改造植物性状的重要环节。遗传转化的效率主要依赖于两个关键步骤：转化（将外源基因转移和在宿主细胞中表达）和再生（从转化细胞形成可育植株的能力）。对于许多物种来说，转化和再生是获得转基因植株的瓶颈。在单子叶和双子叶植物中，一些编码发育调节因子的基因可以有效提高植株的再生效率。在先前的推文“显著提高遗传转化效率，只需一步”中小远给大家介绍了WIND1、BBM-WUS2、GRF4-GIF1以及GRF5基因在提高植物再生效率方面的作用。那么除了上述基因之外，还可以表达哪些基因来提高植物的再生效率及遗传转化效率呢？本期小远就和大家一起来继续聊一聊。

本期推文小远主要讲解绿色的模块 ：

WOX5

遗传转化对于基因功能研究和作物遗传改良都非常重要。近些年，虽然小麦遗传转化技术取得了巨大进展，但是基因型依赖仍是小麦遗传转化中的一个重要影响因素，在很大程度上限制了小麦的遗传改良。2022年2月，Wang等人在Nature Plants杂志上发表了题为“The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation”的研究论文，该文章报道了一个与小麦植株再生相关的基因TaWOX5，利用该基因可以克服小麦遗传转化中的基因型依赖性难题，提高小麦的遗传转化效率。

作者首先通过序列比对和扩增获得了TaWUS和TaWOX5。经过转基因实验发现相比于对照组，在Fielder和CB037小麦中表达TaWUS会导致转化效率降低，而TaWOX5基因的表达则可以显著提高Fielder和CB037这两种模式小麦的转化效率。为了进一步研究TaWOX5对小麦转化的影响，作者在其它商业化小麦品种中也进行了验证，结果显示，表达TaWOX5可以显著提高中麦895、济麦22、轮选987以及京411的转化效率。此外，作者还利用TaWOX5成功转化了几个已知的难转化品种如：宁春4号、矮抗58、西农979等（图1）。进一步的研究表明，TaWOX5基因还可以提高波兰小麦、栽培一粒小麦、黑麦、小黑麦、大麦和玉米等单子叶植物的遗传转化效率。总之，TaWOX5在谷类作物的遗传转化方面具有很大的应用潜力。

图1 TaWOX5和TaWUS对不同基因型小麦转化效率的影响(Wang et al., 2022)。（a）pWMB111、pWMB111-TaWOX5和pWMB111-TaWUS载体的结构示意图。（b）使用含有TaWOX5或TaWUS的载体以及对照载体pWMB111时Fielder和CB037的转化效率。（c）使用含有TaWOX5和TaWUS-D的载体以及对照载体pWMB111时中麦895、济麦22、郑麦9023、轮选987和京411的转化效率。（d）使用含有TaWOX5的载体和对照载体时29个小麦品种的转化效率。（注：TaWUS基因在小麦A、B、D基因组上各存在1个拷贝 ）

图2 利用TaWOX5基因显著提高了不同小麦基因型的再生效率(Wang et al., 2022)。

DOFs

在前文以及“显著提高遗传转化效率，只需一步”中，我们已经了解到表达WOX5和GRF4-GIF1可以有效地提高小麦的遗传转化效率。那么是否还有其它基因可以提高小麦的遗传转化效率呢？答案当然是肯定的。近期，Liu等人在Nature Plants上发表的题为“Uncovering the transcriptional regulatory network involved in boosting wheat regeneration and transformation”的研究论文为大家揭示了两个能够提高小麦遗传转化效率的新基因。

在该研究中，作者以Fielder小麦作为材料，利用RNA-seq、ATAC-seq、CUT&Tag等技术手段，通过多组学联合分析的方式绘制了小麦再生过程的转录及染色质动态图谱，并搭建了一个转录调控网络，从中鉴定到了446个核心转录因子。紧接着，作者通过比较小麦与拟南芥的再生过程，发现在小麦愈伤组织中最早被激活的是DOF和G2-like家族成员，而在拟南芥中最早被激活的则是NAC和LBD家族成员（这两个家族成员的表达能够促进拟南芥再生），因此，作者在小麦中测试了DOF家族的两个转录因子：TaDOF5.6和TaDOF3.4，结合转基因实验发现这两个转录因子能够提高Fielder、KN199以及JM22的愈伤组织诱导率和遗传转化效率（图3）。

图3 DOFs可以促进小麦的再生(Liu et al., 2023)。（a）载体结构示意图。（b）GUS、TaDOF5.6或TaDOF3.4过表达后小麦的再生表型。（c-d）GUS、TaDOF5.6或TaDOF3.4过表达后小麦的愈伤组织诱导效率（c）和转化效率（d）。

图4 小麦再生过程中表观遗传相关转录调控的工作模型(Liu et al., 2023)。

PLT5

模式植物金鱼草虽然具有多样的遗传背景和成熟的转座子诱变系统。但是，由于缺少稳定的遗传转化系统，金鱼草在遗传学和分子生物学中的研究受到了一定的制约。2022年8月，Lian等人在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为“Application of developmental regulators to improve in planta or in vitro transformation in plants”的研究论文。在该论文中，作者通过农杆菌注射的转化方法，研究了几个拟南芥发育调控基因（DRs）的表达对金鱼草转化效率的影响（图5）。结果显示，PLT5的表达可以促进金鱼草地上茎伤口处愈伤组织的形成和芽再生，并且转入的基因可以在子代中稳定遗传（图6）。此外，作者利用相同的注射方法对番茄进行了转化，结果也显示PLT5促进番茄转化效率的提升。最后，作者通过体外组织培养的方法进一步研究了PLT5的表达对油菜和甜椒转化效率和再生出芽效率的影响。结果显示，PLT5的表达能够显著提高油菜的转化率和出芽再生率，而在甜椒中PLT5的表达主要是促进胚性愈伤组织的形成。总之，该研究的发表证实了PLT5可以促进不同物种的遗传转化效率的提升。

图5 载体示意图(Lian et al., 2022)。（a）对照组表达载体POX135-DEL含有35S启动子驱动的GFP和NPT基因，以及2×35S启动子驱动的花青素合成基因AnDel。（b）DR（发育调控因子）表达载体含有来自拟南芥的不同的发育调控基因PLT5、ESR1、WUS-P2A-BBM、WUS、WIND1。

图6 发育调控基因对金鱼草转化效率和再生能力的影响(Lian et al., 2022)。（a）将70日龄的金鱼草的初生芽和相邻的两个腋芽切除，腋芽切除时保留约0.3毫米的茎基部用于农杆菌注射。（b）在如图所示的注射部位注射含有不同DRs的农杆菌（GV3101）。（c）在伤口位置注射农杆菌后形成的愈伤组织（红色箭头）。（d）注射后伤口位置再生出新芽（红色箭头），白色箭头所示的芽是从腋生分生组织位点出现。（e）芽茎中DEL基因过度表达产生的鲜红色表型（白色箭头）。（f）注射含有空载质粒的GV3101作为阴性对照后，植物长出的芽（红色箭头）。（g）f图中红色箭头所指部位的放大图。（h-i）注射含有PLT5质粒的GV3101后的再生芽具有红色的茎（红色箭头）。（j-k）注射农杆菌菌株EHA105（j）或GV3101（k）后，不同DRs对出苗芽、转基因芽和正常形态转基因芽总数的影响。（l）不同DRs注射到伤口位置或腋生分生组织位点时对转化效率的影响。

BBM

由于再生和转化效率低，苹果的功能基因组学研究和性状改良同样受到了很大的限制。2022年1月，Chen等人在Horticulture Research杂志上发表了题为“Significant improvement of apple (Malus domestica Borkh.) transgenic plant production by pre-transformation with a Baby boom transcription factor”的研究论文，该研究表明过表达MdBBM1可以显著提高苹果的转化和再生效率，并产生健康的转基因植物用于再转化研究，这为突破苹果遗传转化障碍提供了一个新的解决方案。

在该研究中，作者用35S-MdBBM1载体转化获得的两种表型的植株（Type 1和Type 2）的叶片在组织培养基上的芽再生效率均显著增强，并且在低苄氨基嘌呤（BA）芽增殖培养基上仍能产生芽，可见MdBBM1显著提升了转基因苗的再生能力（图7）。此外，与转化35S-GUS的对照植株相比，Type 1的大多数植株在温室条件下表现出正常的植株结构，仅有少量植株的叶片卷曲且厚小。结合叶片的显微观察发现，Type 1相较于对照组叶片细胞的分布较为密集，这说明MdBBM1的异位表达能够增强细胞分裂（图8）。通过使用35S-MdALS表达载体对先前获得的GUS过表达株系和具有Type 1表型的MdBBM1过表达株系进行再转化实验，进一步证实了MdBBM1的过表达可以显著提高苹果的转化效率（图9）。最后，作者结合转录组数据分析发现，在用35S-MdBBM1载体转化的植株中与生长素、细胞分裂素以及油菜素类固醇相关的调节因子的转录均发生了变化。

图7 过表达MdBBM1的苹果转基因植株的表型分析(Chen et al., 2022)。

图8 过表达MdBBM1的苹果转基因植株在温室中的表型(Chen et al., 2022)。（a）过表达GUS的苹果转基因植株在温室中生长3个月后的表型。（b-c）过表达MdBBM1的Type 1苹果转基因植株在温室中生长3个月后的表型。（d-f）苹果叶片的显微结构图，横截面（中图）和平行界面（右图）。

图9 过表达MdBBM1提高了苹果的转化效率(Chen et al., 2022)。（a-b）GUS过表达株系（a）和MdBBM1过表达株系（MBM29）（b）的叶片外植体，用含有35S-MdALS载体的农杆菌侵染后，在含有Glean除草剂的芽再生培养基上培养，红色箭头指向愈伤组织和再生的芽。（c-d）转移到补充有4μg/L Glean除草剂的芽维持培养基上光照培养4周后，没有被侵染（c）或被侵染（d）的MBM29外植体的表型。（e）GUS、MBM29以及三个重新转化的MBM29株系的再生芽在补充有100μg/L Glean除草剂的芽维持培养基上光照培养4周。（f）GUS、MBM29以及三个重新转化的MBM29株系中MdALS的表达分析。（g-h）GUS（g）和MBM29-ALS（h）株系的植株在温室中被喷洒60mg/L的Glean除草剂4周后的表型。

GRF4-GIF1-BBM

在先前的推文“快速get玉米高效遗传转化的方法”中，小远给大家详细介绍过使用BBM-WUS2共转化可以有效的提高玉米的遗传转化效率，但是Bbm/Wus2的异位表达会影响再生植株的生长，并造成不育，针对这一问题，小远在前文中也为大家提供了一些解决方案。而除了BBM-WUS2共转化的方法外，Chen等人在BioRxiv上刊登了一篇题为“The combination of morphogenic regulators BABY BOOM and GRF-GIF improves maize transformation efficiency”的研究论文，为大家又提供了一种新的提高玉米转化的方法。该团队经过研究发现通过结合玉米BABY BOOM形态调控基因和小麦GRF4-GIF1基因，在不干预愈伤组织诱导的情况下可以大幅度提高玉米的遗传转化效率。

在该研究中，作者首先构建了一系列基于pBUE411骨架的载体，并将ZmBBM和GRF4-GIF1组装到了载体上（图10）。接着以Hi-II和B104玉米为材料进行了转化实验。结果显示，利用pBUE411-GGB载体结合QuickCorn方法(Masters et al., 2020)可以有效的缩短玉米的转化时间（图11）。并且与对照组相比，包含ZmBBM和GRF4-GIF1的pBUE411-GGB载体能够显著增加玉米的转化效率，经过统计Hi-II和B104的转化效率分别为37%和26%（表1）。最后，作者通过对玉米阳性苗进行PCR特异性检测以及表型观察、统计，发现利用pBUE411-GGB获得的转化苗并未观察到显著的生长缺陷，这表明该系统在提高玉米转化效率的同时不会影响玉米的表型。

图10 本研究所使用的载体结构示意图(Chen et al., 2022)。（a）用于玉米稳定转化的双元载体图。（b）用于生成独立gRNA盒的两个入门载体图。

图11 用pBUE411-GGB载体转化的玉米表型以及与传统转化所需时长的比较(Chen et al., 2022)。（a）用作外植体的玉米自交系B104的幼胚。（b）用含有pBUE411-GGB载体的农杆菌侵染幼胚6天后，体细胞胚出现在胚胎盾片侧的表面。（c）侵染6-7周后生根培养基上再生植株的表型。（d）在生长室中土培的再生植株。（e）GGB转化系统与传统转化相比的时间线（INF+CC，侵染和共培养；SFM，芽形成培养基；RFM，生根培养基）。

表1 两种不同遗传背景的玉米的转化效率(Chen et al., 2022)。

注：字母（A-U）表示CRISPR-Cas9的目标基因，但M和N表示两个荧光报告基因载体。

小远还有话说

除了上述的研究成果之外，近期科研工作者们还鉴定到了玉米体细胞胚胎再生的关键基因Wox2a，从研究结果来看该基因在打破玉米遗传转化的基因型限制方面具有很大的潜力。具体的研究内容，跟着小远一起来了解一下吧。

Wox2a

常规的玉米转化一直局限于一个狭窄的种质范围，这在很大程度上限制了玉米功能基因研究和作物改良的发展。2023年6月，McFarland等人在Plant Biotechnology Journal杂志上发表了题为“A key to totipotency: Wuschel-like homeobox 2a unlocks embryogenic culture response in maize (Zea mays L.)”的研究论文。该研究基于正向遗传学的方法，鉴定了一个诱导玉米体细胞胚发生、胚性愈伤组织形成和植株再生的候选基因。

在该研究中，作者首先以A188基因型和B73基因型玉米为亲本材料，通过杂交获得了一系列的玉米株系，接着利用此群体鉴定到了一个位于3号染色体上，与胚性培养响应相关的区域，并通过基因位置和表达模式选出了3个候选基因：Wox2a、Gras23和Gme1。为了明确候选基因对玉米遗传转化的影响，作者构建了由组成型启动子驱动候选基因表达的载体，并进行了遗传转化实验（图12）。结果显示，Gras23和Gme1在B73中异位表达并未表现出任何预期表型，而Wox2a基因在B73中的异位表达能够诱导体细胞胚胎发生以及胚性愈伤增殖（图13）。作者还进一步比较了Wox2a-B73和Wox2a-A188等位基因编码序列的功能是否存在差异，结果显示两者均能强烈的诱导体细胞胚的发生，这说明在两个基因型中Wox2a等位基因均能够作用于胚性培养。最后作者还观察了通过表达Wox2a获得的B73再生植株的表型，发现再生植株T0代和T1代均表型正常（图14）。

图12 载体FA13-FA21的T-DNA线性图谱(McFarland et al., 2023)。

图13 用ZmUbi1::Wox2a-B73双元载体处理的B73幼胚的转化情况(McFarland et al., 2023)。左上：用农杆菌接种后的幼胚；右上：红色箭头指示的是外植体上产生的体细胞胚；左下：体细胞胚的TdTomato信号；右下：幼苗的再生情况。

图14 T0代和T1代转基因植株的分析(McFarland et al., 2023)。（a）通过PCR分析玉米再生幼苗是否为转基因植株。（b-c）在转基因玉米种子中Tdtomato主要在胚胎中表达。（d）T1种子的多重PCR分析。

小远叨叨

文章至此就告一段落了！在本次推文中小远主要是在前期推文“显著提高遗传转化效率，只需一步”的基础上，又给大家介绍了几种通过表达生长发育调节因子来提高小麦、玉米、番茄、油菜、金鱼草、苹果等植物遗传转化效率的方法，希望本次推文的内容可以对大家的研究有所帮助，当然，总结不到位的地方也欢迎大家一起来补充。另外，我司可以为大家提供小麦、玉米、番茄、油菜等二十二大物种的遗传转化服务，有需要的小伙伴可以查询我司官网或致电详询哦！

References：

Chen Z, Debernardi JM, Dubcovsky J, et al. The combination of morphogenic regulators BABY BOOM and GRF-GIF improves maize transformation efficiency. BioRxiv, 2022.

Chen J, Tomes S, Gleave AP, et al. Significant improvement of apple (Malus domestica Borkh.) transgenic plant production by pre-transformation with a Baby boom transcription factor. Hortic Res. 2022, 9:uhab014.

Lian Z, Nguyen CD, Liu L, et al. Application of developmental regulators to improve in planta or in vitro transformation in plants. Plant Biotechnol J. 2022, 20(8): 1622-1635.

Liu X, Bie XM, Lin X, et al. Uncovering the transcriptional regulatory network involved in boosting wheat regeneration and transformation. Nat Plants. 2023, 9(6): 908-925.

McFarland FL, Collier R, Walter N, et al. A key to totipotency: Wuschel-like homeobox 2a unlocks embryogenic culture response in maize (Zea mays L.). Plant Biotechnol J. 2023.

Masters A, Kang M, McCaw M, et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. J Vis Exp. 2020, (156).

Wang K, Shi L, Liang X, et al. The gene TaWOX5 overcomes genotype dependency in wheat genetic transformation. Nat Plants. 2022, 8(2): 110-117.

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