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导读

干旱已成为全世界农业生产中经历的最严重的非生物胁迫之一。植物通过叶片中的气孔运动来应对水分不足，而气孔运动主要受脱落酸（ABA）调节。本研究人员前期研究发现，玉米（Zea mays L.）GOLDEN2-LIKE（GLK）转录因子在水稻（Oryza sativa L.）的组成型表达可以改善田间条件下的气孔导度和植物光合能力。在本研究中，研究人员发现了ZmGLKs在水稻受到干旱胁迫时具调节气孔运动的功能。在水稻植株中过表达ZmGLK1或GOLDEN2（ZmG2）可显著提高其耐旱性，该过程受ABA介导的气孔快速关闭的调节。研究人员对水稻叶片的RNA-seq测序数据和离体的DNA亲和纯化测序（DAP-seq）结果的比较分析表明，ZmGLKs在调节ABA相关和胁迫响应途径中发挥作用。在DAP-seq数据中，与非生物胁迫耐受性密切相关的4个上调基因被确定为水稻中ZmGLK1和ZmG2的假定靶基因。本研究的相关结果表明，玉米GLKs在调节气孔运动以协调光合作用和抗逆性方面发挥着重要作用。该性状是在不影响光合作用能力的情况下培育耐旱作物的重要目标。

论文ID

原名：Maize GOLDEN2-LIKE proteins enhance drought tolerance in rice by promoting stomatal closure

译名：玉米GOLDEN2-LIKE蛋白通过促进气孔关闭来增强水稻的耐旱性

期刊：Plant Physiology

IF：7.4

发表时间：2023年10月

通讯作者：周文彬

通讯作者单位：中国农业科学院作物科学研究所

DOI号：10.1093/plphys/kiad561

实验设计

结果

1 ZmGLK1和ZmG2提高了水稻的抗旱性

在研究者之前的研究中，在玉米泛素（ZmUBI）启动子驱动下，组成表达ZmGLK1或ZmG2的田间转基因水稻品系表现出更高的光合速率和更高的气孔导度。通过生长室进行盆栽试验，研究者进一步探讨了转基因水稻植株气孔对水分亏缺的响应。令人惊讶的是，转基因水稻植株在经过干旱处理10d后，表现出比野生型（WT）植株更强的抗旱性（图1A）。其中，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植株在6d恢复期后的存活率为53.0%-64.0%，显著高于WT（14.3%；图1b）。此外，干旱处理前WT和转基因植株叶片的相对含水量（RWC）在94.7%-95.3%之间，干旱胁迫7d后，WT叶片的相对含水量（RWC）下降到73.1%。相比之下，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植株保持了较高的RWC，特别是ZmUBIpro:ZmG2植株的RWC在86.2%-90.9%之间。干旱胁迫10d后，WT和ZmUBIpro:ZmGLK1植株的RWC值降至11.6%-12.9%，显著低于ZmUBIpro:ZmG2植株（14.5%-18.6%；图1c）。这些结果表明，ZmGLK1和ZmG2具有更高的保水能力和耐旱性。

接下来，研究者检测了WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株在PEG诱导的渗透胁迫下的生长表现，作为干旱模拟。在20% PEG6000中生长10d后，与WT相比，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株表现出较少的萎蔫和黄化现象（补充图S1A）。光系统II的最大量子效率（PSII；Fv/Fm）值是胁迫条件下植物生理状态的重要指标，在PEG处理10d后，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmPG2水稻植株的Fv/Fm值（分别为0.793和0.803）显著高于WT（0.765）（补充图S1B）。研究者还监测了PEG处理期间水稻幼苗RWC的变化。结果表明，与WT相比，转基因植株的RWC值显著提高。具体而言，与WT相比，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的RWC值分别高出11.4%-12.1%和29.5%-29.7%（补充图S1C）。上述结果表明，水稻过表达ZmGLK1和ZmG2显著提高了水稻对干旱和渗透胁迫的耐受性。

图1.ZmGLK1和ZmG2的过表达提高了水稻的抗旱性。A）干旱胁迫下WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的表型。三周龄的WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻幼苗在土壤中生长，通过停水10d进行干旱胁迫，然后浇水6d恢复期。上、中、下三幅图分别为干旱胁迫前、干旱胁迫10d后和恢复6d后的代表性植物。比例尺:2cm。B）WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株在干旱胁迫10d后恢复6d后的存活率。数据以4个生物重复的平均值±SD表示。C）干旱胁迫0、7、10d后WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2叶片的RWC。数据以4-6个生物重复的平均值±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01（t检验）。

2 ZmGLK1和ZmG2诱导干旱胁迫下水稻植株气孔快速关闭

为了进一步研究ZmGLK1和ZmG2基因耐旱性提高的生理机制，研究者评估了干旱处理对生长室内盆栽水稻幼苗气孔性状的影响，因为气孔是植物与外界大气进行CO2和H2O等气体交换的最主要通道，是干旱条件下光合作用的主要限制因素。因此，研究者首先使用LICOR-6400XT便携式光合系统在控制条件下测量气孔导度和光合作用相关参数。结果表明:ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2的气孔导度分别为0.118-0.139和0.126-0.131，显著高于对照（0.083）；同时，转基因植株的光合速率、细胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（补充图S2）也比在田间生长的植株高。相比之下，干旱处理7d后，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株气孔导度急剧下降（分别为0.062-0.073和0.054-0.059），而WT在干旱条件下保持相对稳定（0.087；补充图S2B）。在干旱条件下，ZmUBIpro：ZmGLK1和ZmUBIpro：ZmG2水稻植株的光合速率、Ci和蒸腾速率均相应下降（补充图S2、A、C和D）。

接下来，研究者比较了WT与ZmUBIpro：ZmGLK1和ZmUBIpro：ZmG2在正常和干旱条件下的气孔性状。无论在何种条件下，转基因植株叶片气孔密度均高于WT，但气孔明显短于WT（图2A至C）。有趣的是，在正常条件下，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻叶片气孔明显比WT更宽（图2D），而在干旱胁迫下，转基因植株气孔宽度显著减小且低于WT，与气孔孔径数据一致（图2E）。

考虑到生长室内相对较低的光照强度可能导致气孔关闭，研究者进一步在自然光的温室中进行了盆栽试验，以排除弱光的影响。结果与室内实验结果一致（图1）。在10d的干旱期间，由于水分的快速流失，所有植物都受到了严重的损害（补充图。S3；图3A）。复水7d后，研究者观察到ZmUBIpro：ZmGLK1和ZmUBIpro：ZmG2水稻植株的存活率较高（图3B），且在干旱或恢复阶段叶片RWC均显著高于WT（图3C）。此外，研究者还监测了干旱期间光合速率和气孔导度的动态变化，发现水分充足条件下ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的光合速率和气孔导度更高。然而，随着干旱加剧所有植株的光合速率和气孔导度普遍下降，其中ZmUBIpro：ZmGLK1和ZmUBIpro：ZmG2水稻植株的光合速率和气孔导度均低于WT（图3D和E）。这些结果清楚地表明，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的水分亏缺引发了气孔的快速关闭，进一步提高了水稻的耐旱性。

图2. 正常生长和干旱胁迫7d后WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻叶片气孔密度和气孔开放状态的比较。A）WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻叶片气孔的扫描电镜（SEM）图像。标尺:50μm。在正常生长条件或干旱胁迫下生长7d的WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植株叶片中B）气孔密度，C）气孔长度，D）气孔孔径，E）气孔比。B）中的数据表示为平均值±SD（n＞8个生物重复）。C-E中的箱线图显示中位数（水平线）和单个值（点；N＞15个生物重复）。*P＜0.05，**P＜0.01（t检验）。

图3. ZmGLK使气孔快速关闭，以防止干旱期间水稻的水分流失。A）干旱胁迫下WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的表型。60日龄的WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株在自然光温室的土壤中生长，通过停水10d进行干旱胁迫，然后重新浇水，进行7d的恢复期。上、中、下三幅图分别为干旱胁迫前、干旱胁迫10d后和恢复7d后的代表性植物。比例尺:10cm。B）WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株在干旱胁迫10d和恢复7d后的存活率。C）WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻叶片在干旱胁迫0、7d和恢复7d后的RWC。D，E）干旱胁迫下WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株光合速率D）和气孔导度E）的动态变化。数据以3-6个生物重复的平均值±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01（t检验）。

3 ABA介导了ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株气孔快速关闭的调控

在干旱胁迫下，ABA是调控气孔运动以应对干旱的关键植物激素。为了进一步分析ZmGLK1和ZmG2诱导气孔运动的潜在机制，研究者对水稻植株进行了ABA处理，以明确气孔快速关闭是否由ABA诱导。施用100μM ABA 2.5h后，水稻ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植株的光合速率显著降低，气孔导度也显著降低（图4A和B）。因此，施用ABA后，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的Ci和蒸腾速率普遍低于WT植株（图4C和D）。外源ABA对WT和转基因植物光合特性和气孔导度的影响模拟了干旱胁迫处理的结果，表明ZmGLK1和ZmG2对响应水分亏缺胁迫的快速气孔关闭的调节是ABA介导的。

图4. 外源ABA降低了ZmGLK1或ZmG2过表达水稻植株的光合速率和气孔导度。ABA处理前或2.5小时后在土壤中生长的3周龄WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的A）光合作用速率，B）气孔导度，C）Ci和D）蒸腾速率。数据显示为3个生物学重复的平均值±SD。*P＜0.05，**P＜0.01（t检验）。

4 ZmGLK1和ZmG2调控气孔相关基因促进耐旱性

为了进一步了解干旱胁迫下ZmGLKs调控的分子机制，研究者接下来比较了WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株在正常和干旱胁迫条件下气孔运动相关基因的表达水平。在正常条件下，与WT相比，转基因植株中几个关键基因的表达量较高，但在干旱胁迫下却显著下调。其中包括4个编码与内向整流钾通道相关的蛋白质（3个OsKAT和1个OsAKT1基因）、1个H+-ATP酶（OsAHA7）和几个应激反应基因（包括OsbZIP23、OsP5CS1和OsLEA3；图5）。这些结果表明，ZmGLK1和ZmG2在水分亏缺时通过下调气孔运动相关基因来提高抗旱性。

研究者还对外源ABA处理后3h的WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株进行了全基因组转录组学分析，以研究外源ABA对ZmGLK1和ZmG2的影响，特别是对气孔运动的影响。与ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植物相比，WT植物明显表现出不同的表达模式，如通过主成分分析（PCA）的清晰分离证明了这一点（图6a）。具体来说，在ABA处理后，与WT相比，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植物中分别有702和775个基因显著上调，其中482个基因在两个转基因品系中均上调（图6B）。基因本体（GO）术语富集分析显示，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2植物中上调的差异表达基因（DEGs）在多种生物过程中发挥作用，但主要是ABA和水分剥夺途径（图6C和D）。接下来，研究者进行DNA亲和纯化测序（DAP-seq）分析，以鉴定ZmGLK TFs直接调控的基因。该分析揭示了水稻基因组中ZmGLK1和ZmG2的假定的结合位点分别为6601和6565个，其中超过一半的已识别位点同时与ZmGLK和ZmG2结合（补充图S4A）。在ZmGLK1和ZmG2共有的3835个结合位点中，17.44%定位于启动子，8.59%定位于外显子，45.26%定位于基因间隔区（补充图S4A）。基序分析表明，在ZmGLK1-和zmg2-结合区发现的最富集的核心基序是GCCTCT和AGATTCT（补充图S4，C和D）。从DAP-seq数据中鉴定出59个基因作为水稻中ZmGLK1和ZmG2的潜在靶点，从RNA测序（RNA-seq）数据中鉴定出这些基因在过表达ZmGLK1或ZmG2的植物中也差异表达（图6b；补充表S1）。研究者注意到4个上调的DEGs被注释为非生物胁迫耐受性，并同时在DAP-seq分析中显示出强结合峰。因此，这些基因被确定为水稻中ZmGLK1和ZmG2的假定靶基因，包括水稻基因丝状温度敏感蛋白H6（OsFtsH6）、细胞色素P450家族714B1（OsCYP714B1）、红叶绿素分解代谢物还原酶1（OsRCCR1）和枯草杆菌蛋白酶57（OsSub57；图7A至D）。从RNA-seq数据来看，这4个基因的基因表达量在ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株中显著较高（图7E到H）。研究者进一步的反转录定量PCR（RT-qPCR）分析证实，在干旱胁迫条件下，这些基因在水稻ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2中被高度诱导（图7I至L）。这些假定的靶基因可能通过在水分亏缺时使气孔快速运动而有助于增强耐旱性。

图5. WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻气孔运动和气孔孔径相关基因在正常条件和干旱胁迫7d后的相对表达量。A）OsKAT1，B）OsKAT2，C）OsKAT3，D）OsAKT1，E）OsAHA7 F）OsZIP23，G）OsLEA3，H）OsP5CS1，I）OsERD1的表达水平。采用RT-qPCR技术检测在正常条件或干旱胁迫条件下在土壤中生长3周的水稻植株叶片中的基因表达水平。数据以3个生物学重复的平均值±SD表示。*P＜0.05，**P＜0.01（t检验）。

图6. ABA处理3小时后WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株的转录组分析。A）基于RNA-seq数据的水稻WT、ZmUBIpro:ZmGLK1-3和ZmUBIpro:ZmG2-3基因表达PCA分析。B）与WT相比，ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻植株中独特且重叠的DEGs表达上调，并且从DAP-seq数据中鉴定出独特且重叠的ZmGLK1和ZmG2靶基因。DEG是根据|log2 FC|＞1和P＜0.05通过“DESeq”R包进行识别的。C，D）与WT相比，ZmUBIpro:ZmGLK1 C）和ZmUBIpro:ZmG2 D）水稻植株中DEG上调的GO功能类别。气泡大小表示对应GO类别中DEG计数的数量；气泡强度对应于−log10（错误发现率[FDR]值）；x轴表示每个GO类别中的DEG与该类别中所有基因的比例。

图7. 水稻中ZmGLK1和ZmG2假定的靶基因。A-D）DAP-seq表明ZmGLK1和ZmG2优先与OsSub57 A），OsFtsH6 B），OsCYP714B1 C）和OsRCCR D）的启动子结合。E-H）通过RNA-seq分析测定的WT水稻和过表达ZmGLK1或ZmG2的水稻中OsSub57 E），OsFtsH6 F），OsCYP714B1 G）和OsRCCR H）的表达水平。在RPKM中计算基因表达。I-L）OsSub57 I），OsFtsH6 J），OsCYP714B1 K）和OsRCCR L）。采用RT-qPCR检测在对照条件下和干旱胁迫7d后在WT、ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2水稻中的相对表达水平。数据以3个生物重复的平均值±标准差表示。*P＜0.05、**P＜0.01（t检验）。

讨论

GLK TFs长期以来被认为是叶绿体生物合成和光合细胞器形成的一些最重要的调节因子。它们已在拟南芥、番茄（Solanum lycopersicum L.），和玉米中被鉴定出来。在水稻中，玉米GLK基因（ZmGLK1和ZmG2）的异位表达促进了叶片解剖中的原Kranz状态，增加了水稻维管束鞘细胞的叶绿体和线粒体发育。研究者实验室之前的一项研究表明，过表达玉米GLK基因的水稻植株在强光和波动光条件下提高了光合能力并减少了光抑制，从而增加了生物量和谷物产量。

在本研究中，研究者发现玉米GLK基因（ZmGLK1和ZmG2）在水稻中的过表达通过促进气孔关闭来增强抗旱性。具体来说，当植株生长在标准的、水分充足的条件下时，研究者观察到与WT植物相比，过表达ZmGLK1或ZmG2的水稻植物的气孔尺寸更小，但气孔密度和气孔孔径更高（图2B和E）。这些结果与早期的研究结果一致，表明ZmGLK1和ZmG2过表达导致大田水稻、温室水稻和拟南芥的气孔导度增加。相反，在干旱胁迫下，过表达ZmGLK1或ZmG2的水稻植株气孔迅速关闭（图2B和3E），通过防止水分流失来提高抗旱性。先前对水稻的研究报道，小而高密度的气孔可以快速关闭，从而促进对干旱胁迫的恢复力；这些先前的结果与本研究的结果一致。值得注意的是，ZmGLK1或ZmG2过表达导致对照和干旱胁迫植物气孔状态的差异是由气孔运动相关基因的调控直接引起的，即内向K+通道和H+-ATP酶（如OsKATs、OsAKT1和OsAHK7；图5）。正常情况下，ZmGLK1或ZmG2过表达上调K+通道基因，这与先前在拟南芥中的研究一致，表明GLK是K+通道基因和气孔运动的正调节因子；因此在干旱条件下，这些基因的表达水平显著降低，直接导致转基因水稻的气孔快速关闭。

值得注意的是，研究者验证了响应水分亏缺的快速气孔关闭的调节是由ABA介导的，与WT相比，外源应用ABA在ZmUBIpro:ZmGLK1和ZmUBIpro:ZmG2株系中诱导更快的气孔关闭支持了这一点（图4B），其模拟了干旱胁迫的影响。研究者的发现与之前的研究一致，即快速气孔关闭需要ABA敏感性高。本研究结果还表明，ZmGLKs可能在ABA生物合成途径中发挥作用，这表明ABA积累量较高（补充图S5），以及参与ABA生物合成的几个关键基因（如；OsNCED2、OsNCED3、OsAAO3和OsZEP1）对干旱的响应（补充图S6）。ABA的生物合成始于玉米黄素的环氧化反应，因此这种叶黄素前体在ABA的生物合成中起着重要的作用。研究者之前发现ZmGLKs增加了叶黄素的水平，包括玉米黄质和叶黄素，这可能以这种方式改善了ABA的生物合成。此外，在拟南芥中的一项研究表明，GLKs直接激活WRKY40的表达，并且GLK-WRKY40共同负调控ABA信号通路，这表明ZmGLKs可能在ABA信号通路中发挥调控作用。研究者还提出，ZmGLKs赋予的C4样性状可能有助于气孔的快速关闭。模型模拟和实验数据已经证明，与C3作物相比，主要C4作物在应对水分亏缺时能够更快地关闭气孔，从而提高水分利用效率（WUE）。值得注意的是，之前的研究表明，与被子植物相比，蕨类植物的气孔关闭速度较慢与对ABA和糖的反应性降低有关，而在禾草物种中，保护细胞和辅助细胞之间离子和渗透物的快速运输有助于快速的气孔运动。过表达ZmGLK的水稻植株具有改善的碳水化合物含量，与番茄植株中SlGLK基因的表达一致；这可能有助于在代谢水平上快速关闭气孔。

为了进一步揭示ZmGLK调节气孔运动的机制，研究者对RNA-seq和DAP-seq数据进行了比较分析。该分析揭示了几个潜在的靶基因显示出强结合峰，包括OsFtsH6、OsCYP714B1、OsRCCR1和OsSub57（图7）。OsFtsH6属于OsFtsH基因家族，作为PSII修复周期的一部分参与D1蛋白周转。D1周转包括位于叶绿体中的FtsH蛋白酶去除受损的D1蛋白，然后将新合成的D1蛋白协调组装到类囊体膜中。研究者在之前的研究中发现，ZmGLK1和ZmG2过表达的植物中存在高水平的D1蛋白，促使研究者推测ZmGLKs对OsFtsH6表达的潜在调节功能。OsCYP714B1编码赤霉素（GA）13-氧化酶，在GA13-羟基化中发挥关键作用，从而调节植物生长。OsRCCR1编码叶绿素降解酶；敲除OsRCCR1会导致老叶褪绿病变和提前衰老。此外，OsSub57被注释为编码盐和干旱诱导的枯草杆菌蛋白酶同系物，但其功能仍然未知。然而，由于基因调控系统的复杂性，异源基因赋予的转录调控是否保守或与本地物种不同仍然是一个悬而未决的问题。

气孔关闭被认为是大多数植物对干旱胁迫的第一反应，防止蒸腾造成的水分流失。提高气孔响应速度是同时最大化光合作用和水分利用效率的可行有效策略。值得注意的是，ZmGLK过表达植物的潜在靶基因功能和调控作用以及气孔动力学的量化研究仍需进一步深入，以了解ZmGLK调控气孔运动的机制，协调光合作用与耐旱性之间的权衡。进一步的探索将为作物育种提供见解和有用的目标，从而能够创造出具有高光合能力和耐旱性的优良品种。