荧光蛋白质免疫印迹实验步骤(在牛奶中孵育一抗)

注:双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液,则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验,以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

Cell Signaling Technology (CST) 提供的产品与各自对应的货号相链接。

注:用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

印迹膜: 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化(推荐)。

从培养物中吸出培养基;使用冷的 1X PBS 洗涤细胞;吸取。

加入 1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

超声处理 10–15 秒,完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。

注:建议将预染蛋白分子量标准品(#7720,10 µl/泳道)上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

电转移至硝酸纤维素膜。

在 4°C 下,将膜和一抗(按产品数据表中建议的相应稀释度)放在 10 ml 抗体稀释缓冲液中孵育,轻轻搅动,过夜。

将膜上多余的 TBS/T 沥干,并让它干燥。

请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。