荧光蛋白质免疫印迹实验步骤（在牛奶中孵育一抗）

注：双色蛋白质印迹法需要不同物种的一抗和标记有不同染料的二抗。如果一抗需要不同的一抗孵育缓冲液，则在两种缓冲液中分别对每种一抗进行检验，以确定最适合进行双重标记实验的缓冲液。

Cell Signaling Technology (CST) 提供的产品与各自对应的货号相链接。

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

印迹膜： 本实验步骤已针对硝酸纤维素膜进行了优化（推荐）。

从培养物中吸出培养基；使用冷的 1X PBS 洗涤细胞；吸取。

加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板每平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。

超声处理 10–15 秒，完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。

注：建议将预染蛋白分子量标准品（#7720，10 µl/泳道）上样以验证电转移和确定分子量。预染标准品在近红外波长范围内具有自发荧光。

电转移至硝酸纤维素膜。

在 4°C 下，将膜和一抗（按产品数据表中建议的相应稀释度）放在 10 ml 抗体稀释缓冲液中孵育，轻轻搅动，过夜。

将膜上多余的 TBS/T 沥干，并让它干燥。

请使用合适的荧光扫描仪并根据制造商的建议扫描膜。