电泳根据分子的大小，电荷或其他特性沿梯度将其分离。该梯度可以是电场，或者在变性梯度凝胶电泳（DGGE）的情况下，可以是变性剂，例如尿素和甲酰胺的混合物。如果带负电荷，蛋白质将向阳极迁移，如果带正电荷，则蛋白质将向阴极迁移。由于大分子的迁移要比小分子慢，因此科学家可以测量行进的距离并使用对数确定碎片的大小。
在电泳基于电荷分离的情况下，缓冲液中的离子会传输分离所需的电荷。通过提供弱酸和弱碱的缓冲液，缓冲液还将pH值保持在狭窄的范围内。这很重要，因为蛋白质或核酸的结构和电荷在pH发生明显变化时会发生变化，从而阻止了正确的分离。