文|历史安利官

编辑|历史安利官

棉花是世界上各个国家重要的战略性军事资源物质，也是一类具有纺织功能的经济作物。

中国是棉花种植生产的大国，中国的主要种植产地位于中西部地区，以新疆地区为主。

棉花的产量受限于种植产地的干旱气候条件及土壤盐碱含量较高等不利影响。

棉花抗逆生理

因此,研究棉花抗逆生理及分子机制，对于改良棉花的抗盐碱、抗干旱性，在一定程度上提高棉花的产量和品质，从而满足工业生产需要。

多胺作为一种提高植物抗逆性的天然激素功能类物质，其生理功能已经被很多的研究证实。

然而在棉花中，多胺对于抗逆性的作用机制仍然不是很清楚。

多胺氧化酶是一类调节多胺代谢的一种重要酶，通过多胺氧化酶的氧化作用分解多胺，从而维持植物有机体多胺的动态平衡，因此研究棉花多胺氧化酶调节多胺含量与棉花抗逆性的相关性十分必要。

在本研究中，我们通过生物信息学分析，结合荧光定量分析筛选鉴定出可能与多胺氧化酶相关的PAO家族候选基因，并且从陆地棉中克隆得到其中一个候选基因GhPAO11。

通过将获得的基因过表达转入野生型拟南芥，对GhPAO11转基因的拟南芥植株进行抗逆性表型观察和GhPAO11表达功能分析。

同时进行多胺含量测定，这些研究初步揭示了GhPAO11在棉花抗逆中的功能，为培育和筛选具有抗盐碱、抗旱等抗性新品种提供理论依据：

（1）不同胁迫处理条件下，对棉花抗氧化指标进行测定。

（2）通过生物信息学分析，对棉花GhPAO基因家族成员进行鉴定。

（3）进行GhPAO基因表达分析，筛选目标基因。

（4）克隆陆地棉多胺氧化酶基因GhPAO11。

（5）构建真核表达载体，转化野生型拟南芥。

（6）筛选得到转基因拟南芥植株，测定其多胺含量变化。

选用的棉花品种为“中棉79号”，该品种由中国农业科学院棉花研究所赠予使用。

中棉79具有抗逆性强、株型紧凑、产量较高、棉花纤维品质优异等特点。

中棉79种子实验测试

选取脱绒处理的中棉79种子，利用1%的次氯酸钠溶液将种子消毒15min，再用蒸馏水洗净，在光照培养箱中25℃进行催芽3d。

待出芽后将长势大小均匀一致的棉花发芽幼苗转移至细土：蛭石比例为1:1的实验土中进行盆栽，移入已设置好一定程序的人工智能光照培养箱进行培养，培养条件为：光照/黑暗16h/8h,温度28℃，湿度为55%。

培养5d后移栽，在营养液中分别加入0.8%的Nacl和8%的PEG，分别用以模拟盐害和干旱组的处理。

在胁迫处理12h后分别用2μmol/L浓度的三种多胺处理。

真核表达载体（pCambia1301）、大肠杆菌（菌株DH5α）、根癌农杆菌（菌株GV1301）、pMD18-T克隆载体均购自上海生工生化试剂公司，本实验室保存。

（1）试剂盒：棉花的RNA提取试剂盒购自于天根生技公司。

植物的DNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购买于北京全式金公司。

DNA的胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购买于上海生工生物公司。

H2O2试剂盒、POD试剂盒购自索莱宝生物科技公司。

（2）酶的类型：限制性内切酶、EasyTaqDNA酶、T4连接酶、DNAMarker等购买于TaKaRa公司。

（3）试剂：EDTA、NaCl、MgCl2、Tris-HCl、NaOH、NaClO、EDTA、SilwetL-77、DMACA、无水乙醇、PEG-2000、甲醇、乙醚、浓盐酸、β-巯基乙醇、酵母提取物、胰蛋白胨、琼脂粉、蔗糖等试剂。

（4）抗生素：卡那霉素、利福平、超低温冰箱、光照培养箱、电热恒温培养箱、超净工作台、液相色谱仪、水浴氮吹仪、紫外分光光度计、雪花制冰机、凝胶成像仪、摇床、凝胶电泳仪。

电转化仪、荧光定量PCR仪、纯水机、超微量分光光度仪、低温冷冻离心机、PCR仪、移液枪、高压蒸汽灭菌锅。

取棉花样品，加入液氮研磨成粉，然后加入1.5%果胶酶、1%纤维素酶和5mL5%的高氯酸溶液进行过夜浸提，对浸提液6,000r/min的低温离心30min。

然后取500mL的离心的上清液加入15mL的苯甲酰氯进行酰化反应、加入1mLNaOH用以调节pH并充分涡旋震荡20s后，在37℃水浴30min后，加入2mL乙醚、2mL饱和NaCl，6,000r/min低温离心10min。

利用注射器抽取乙醚相1mL，利用氮吹仪的氮气将乙醚相吹干后加入200mL色谱级甲醇进行溶解，再利用注射器过0.22µm有机相滤膜用于UPLC检测。

UPLC检测参数：色谱柱参数为AgilentXDB-C18反相柱(4.6 250mm)；流动相为甲醇:水(70:30V/V)；流速1mL/min；进样量10mL；检测温度30℃；检测波长230nm；保留时间20min。

根据H2O2试剂盒的方法，用研钵对样本材料进行破碎，同时加入丙酮，制备成测定样本溶液。

H2O2含量原理是利用样本中H2O2与硫酸钛生成黄色的过氧化钛化合物。

通过测定样本在415nm处的吸光度值，根据标准曲线分别计算棉花组织中H2O2的浓度。

将洗净的棉花叶（1g）剪碎，加入抽提液（0.1mol/L磷酸缓冲液、0.15mol/LNaCl、pH6.5）进行研磨，过滤离心，加入2ml磷酸缓冲液（PBS，0.1mol/L，pH6.5），同时加入0.2mL的愈创木酚溶液(25mmol/mL)、0.1mL过氧化物酶溶液（1mg/mL），4℃保温2min。

然后分别加入0.1mL浓度为30mmol/L的Spd，所得到的混合液在30℃条件下水浴2min，测定在475nm光密度值的变化数值。

以每分钟光密度值的变化数值达到0.01作为1个酶活力单位。

过氧化物酶(POD)活性的测定则根据试剂盒的方法操作，称取棉花叶1g，按照试剂盒操作说明书，分别加入反应液和酶液。

25℃保温10min,，测定470nm吸光度值。

分别记录在30s时吸光度值（记为对照A1）、90s时吸光度值（记为测定A2），吸光度值变化量为∆A=A2-A1，测定标准曲线后，直接将∆A代入公式可计算POD的数值。

ABA提取（避光操作）：称取1g的棉花叶片样本，加入10ml甲醇；在4℃冰箱中进行浸提12h，5000r/min离心15min，取上清液于4℃保存备用。

向离心后的样本沉淀中加入80%甲醇10mL浸提，重复上述操作两次，将各步浸提得到的上清液合并，加入0.1g的PVPP（交联聚乙烯基吡咯烷酮），4℃摇床振荡（200rpm）1h后放到-80℃超低温冰箱保存。

取用时先置于4℃冰箱中融化，10000r/min离心15min，弃去杂质，用10ml甲醇洗涤3次，最后用甲醇定容至15ml。

60℃旋转蒸发至干燥，加入1mL甲醇，过0.45μm超微滤膜,获得的滤液用于高效液相色谱仪检测。

UPLC检测参数：色谱柱参数为为AgilentXDB-C18反相柱（4.6´250mm）；流动相体积比为甲醇:冰乙酸：水（0.4:0.4：99.2）；流速1mL/min；进样量10mL；检测温度25℃；检测波长210nm；保留时间50min。

对于催芽后移栽5天棉花用浓度为0.8%Nacl和8%PEG处理12h后分别用2.0mmol/l浓度的Put、Spd、Spm以及D-Arg和DADD的处理15株，记录茎长、叶面积等表观性状。

我们选取的拟南芥基因组数据来源于数据库；而雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉全基因组数据则分别来源于数据库。

利用DNATOOLS软件建立以雷蒙德氏棉、亚洲棉、陆地棉基因组蛋白质序列为数据源的本地数据库。

以拟南芥AtPAO1基因保守结构域的氨基酸序列作为查询序列,在已建立的三种棉花氨基酸序列本地数据库进行本地的TblastN序列比对，初步筛选出棉花中的Pao家族基因序列。

将筛选得到的棉花Pao基因序列，分别通过在线软件PFAM进行比对分析，再通过MEGA6.0软件中ClustalW工具进行多重序列比对，将重复序列去除。

通过MEGA6.0软件，分别将三种棉花与拟南芥AtPAO1氨基酸进行比对。

根据棉花中各PAO家族成员与拟南芥AtPAO1的进化关系，进行命名和归类。

再利用MEGA6.0软件将获得的三种棉花PAO和拟南芥AtPAO1进行比对，构建进化树。

通过利用ExPAsy在线软件，对棉花PAO蛋白的等电点、氨基酸序列的长度、蛋白质的分子量等性质进行预测分析。

通过GSDS在线数据库进行Pao基因结构分析。

利用RNA提取试剂盒说明书提取棉花的总RNA，具体步骤如下：

①实验前取新鲜棉花的叶片冲洗洗净后进行研磨粉碎。

用蓝枪头挑取大约50mg粉末置于1.5mL的微量离心管中，并立即加600μL的RB缓冲液，进行涡旋。

②涡旋后在室温下孵育30min至1h，使棉花组织细胞充分裂解。

③室温条件下以14,000g对上述裂解液进行离心5min，转移上清液至核酸纯化柱中，再在室温下以14,000g离心2min后，将接液管中的液体转移至新的离心管中，继续进行涡旋震荡30s。

④将液体加入微型柱，10,000g常温离心1min。

⑤利用DNase酶进行消化。

⑥将微型柱置于新的收集管中，加入400μL的RWC洗涤液，在室温条件下进行孵育5min，以10,000g进行离心1min，弃去废液。

⑦再加500μL洗涤液II，以10,000g离心1min弃去废液，重复该步骤。

⑧10,000g离心微型柱1min，甩干柱子；将微型柱装入离心管中，加30-50μL的DPEC水，以10,000g离心1min，回收接液管中的溶液。

⑨将上述含有棉花RNA的溶液，进行浓度测定，并快速放入-80℃冰箱进行保存备用；取上述方法获得的RNA，按照反转录试剂盒方法对棉花进行cDNA第一条链的合成，在反应试管中加入500ng棉花总RNA、oligo(dT)引物1μL和dNTPmixture2μL,加RNAasefreedH2o至10μL，将上述溶液充分混匀。