增加种植密度是提高间作系统产量的有效途径之一。在农业生产实践中，生产者通过优化主栽作物的种植密度来实现间作产量的提高。

本研究从稀植类作物玉米入手，设置不同的玉米密度梯度，而保持密植类作物豌豆的播种密度不变，进而形成了不同玉米种植密度下玉米间作豌豆、单作玉米以及单作豌豆，共计7个处理。

通过分析作物群体、个体的光合生理特征，叶片解剖结构以及光合关键酶活性及其基因的相对表达量，探究密植条件下间作群体增产的地上部光合生理机制，为量化间作“纳密”潜力提供理论依据。

1.试区概况

试验于2018-2019年在甘肃省武威市凉州区黄羊镇甘肃农业大学武威绿洲农业试验站进行。该区位于甘肃河西走廊东端(37°96N,102°64E)，平均海拔1776m。

1960-2016年长期日平均温度为7.2℃，≥0℃和≥10℃积温分别为3513℃和2985℃，年日照时数2945h，无霜期156d，全年太阳总辐射量为6000MJm-2，年均降水量164mm，降雨分布多集中在7-9月份，年蒸发量达2400mm，属于典型的季风性寒温带半干旱区。

间作因其在平衡粮食高产和提高水分利用效率等方面表现突出，有效缓解了该区资源性缺水和生态用水对农业发展的限制。近年来，为契合可持续农业发展需求，该区传统耗水量较大的玉米间作小麦逐渐被节水节氮的玉米间作豌豆所替代。

试验区土壤为典型的石灰性灌漠土。2018年播前0-30cm土壤特性如表2-1。两年的作物生长季内，气温、降水数据均由甘肃省武威市气象局提供(图2-1)，豌豆生育期降水量分别为47.2mm和119.2mm，玉米生育期降水分别为273.1mm和171.3mm，玉米间作豌豆共生育期内降水分别为46.1mm和115.6mm。

2.主要研究内容

单作和间作群体耐密性差异

比较同一玉米种植密度下不同种植模式间以及相同种植模式下不同密度间的产量表现，量化单作和间作的密植效应，揭示其耐密性差异。

间作群体和个体光合生理对密植的响应特征

比较单作和间作作物群体生长率、净同化率、光合势及干物质转运对密植的响应特征，从作物群体光合生理角度揭示间作耐密机理；比较不同种植模式下作物叶片叶绿素相对含量、光合生理(Pn、Ci、Tr、Gs)特征及叶绿素荧光动力学参数对密植的响应特征，从叶片光合水平为间作耐密性提供理论支撑。

玉米间作豌豆叶片解剖特征对密植的响应

以豌豆收获期为时间节点，分析增密对豌豆收获前、后作物气孔以及叶片微观解剖结构的变化规律，明确豌豆收获前后作物叶片解剖结构对密植的响应特征，为间作耐密从叶片解剖学层面提供理论支撑。

玉米间作豌豆光合关键酶及其基因表达量对密植的响应

分析不同处理间作物的光合关键酶及其基因表达量(PEPC、PPDK、NADPMDH、NADP-ME、Rubisco)，明确玉米、豌豆光合关键酶及其基因表达对密植的响应特征，从基因水平上揭示间作耐密机理。

3.试验材料与方法

供试材料

供试玉米品种为先玉335(ZeamaysL.)，豌豆品种为针叶豌豆陇豌1(PisumsativumL.)。化学氮肥为尿素(N-P2O5-K2O为46%-0-0)和磷酸二铵(NP2O5-K2O为18%-46%-0)；地膜为白色农用地膜(宽120cm，厚0.01mm)。

试验设计

试验采用随机区组设计，设置3种种植模式：玉米间作豌豆(M/P)、单作玉米(M)、单作豌豆(P)；3个玉米种植密度：单作玉米种植密度分别为78,000株/hm2(D1)、103,500株/hm2(D2)、129,000株/hm2(D3)。

相对应的间作玉米密度与单作在净占地面积上保持一致，分别为45,000株/hm2、60,000株/hm2、75,000株/hm2。单作豌豆的播种量为180万株/hm2，相对应的间作豌豆播种量为76万株/hm2。共7个处理，每个处理重复三次。具体试验代码见表2-2。

间作和单作玉米行距不变，通过改变株距控制密度。玉米间作豌豆系统中，玉米带地膜覆盖，间作每条自然带带宽为190cm，其中玉米带110cm，种3行玉米，行距40cm；豌豆带80cm，种4行，行距20cm。

间作每小区设4个自然带。单作玉米覆膜分行种植，行距40cm，单作豌豆分行种植，行距20cm。试验小区为8m×7.6m。于2018年3月28日、7月10日进行豌豆的播种、收获，4月19日、9月28日进行玉米的播种、收获。

于2019年4月1日、7月12日进行豌豆的播种、收获，4月21日、9月29日进行玉米的播种、收获。玉米施纯氮(N)360kg/hm2，按照基肥：大喇叭口期：灌浆期=3：5：2分三次施入，纯磷(P2O5)180kg/hm2全作基肥一次性施入。

豌豆施纯氮90kg/hm2，纯磷45kg/hm2全作基肥。灌水制度与当地传统习惯灌水保持一致。

4.测定指标与方法

群体光合生理指标

玉米播种后(豌豆出苗20d)，每隔15d在每个小区内进行随机取样(玉米10株，豌豆20株)，玉米按茎、叶、鞘(营养生长阶段)以及穗(生殖生长阶段)各自分开测定其生物量；豌豆按茎、叶(结荚期前)以及荚(结荚期后)各自分开测定其生物量，然后于105℃杀青1h后调节烘箱温度至80℃下烘干至恒重并称其干重。

用于计算干物质积累量(DM)、群体生长率(CGR)、营养器官的物质转运量(DTA)、转运率(DTR)以及营养器官对籽粒的贡献率(GCR)。玉米叶面积采用长宽测量法，测定每株各叶片的叶长(ai)和叶宽(bi)；豌豆叶面积采用剪纸称重法测定，计算玉米、豌豆叶面积指数(LAI)、叶日积(LAD)和净同化率(NAR)。

式中DMn和DMn-1分别代表第n和第n-1次取样时的植株干物质积累量(kgha-1)，Tn和Tn-1分别代表取样时间。

光合-荧光相关参数

叶绿素相对含量(SPAD)：采用便携式SPAD-502型叶绿素仪选择晴朗无风的天气于上午9：00-11：00进行测定。于玉米拔节期开始，每隔15d测定一次，在玉米进入生殖生长之前，选择上部完全展开叶进行测量，生殖生长阶段选择穗位叶进行测量。

测量时选择叶片中部位置避开主叶脉，每次测定选取长势一致的玉米3株和豌豆5株并作挂牌标记处理，用于后续光合-荧光的测定，每株测定三次，取其平均值为整株的叶绿素相对含量值。

光合-荧光参数的测定：使用装有荧光叶室(6800-01A)的便携式光合-荧光分析系统(Li-6800,Li-CorInc.,Lincoln,NE,USA)对标记的叶片进行气体交换测量。测量位置同SPAD值测量位置一致，于晴朗无风的早晨(9：00-11：00)在饱和光量子通量密度(PPFD)为1000μmolm-2s-1(90%的红光和10%的蓝光)条件下进行测量，每株测量3次。

采用CO2小钢瓶控制叶室CO2浓度为400μmolmol-1，叶温250.2℃，相对湿度控制在55%，流速300μmols-1。开机预热30min待适应稳定的光合作用后记录净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)。

在测量荧光之前，先用暗适应叶夹使被标记的测量叶片充分暗适应30min，然后通过足够低的调制光(<0.1μmolphotom-2s-1)测得暗适应下的最小荧光(Fo)，然后再打一个0.8s光量子为8000μmolphotom-2s-1的饱和脉冲测得暗适应下的最大荧光(Fm)。

然后再设置一个300μmolphotom-2的光化光连续照射15min，获得稳态荧光(Fs)并打第二次光量子为8000μmolphotom-2s-1的饱和脉冲测得光适应下的最大荧光(Fm’)，关闭光化光用远红光照射3s后测得光适应下的最小荧光(Fo’)。

气孔特征和叶绿素超微结构

以豌豆盛花期（玉米小喇叭口期）、豌豆收获后15d（玉米吐丝期）和玉米灌浆期为时间节点进行豌豆、玉米取样，利用扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)分析豌豆、玉米叶片的微观结构变化。

具体操作为光合-荧光测定结束后将叶片中部位置(避开主叶脉)完整的剪下，从中剪取1-3mm2长条置于装有2.5%的戊二醛电镜专用固定的离心管中，于4℃固定4h后用pH=7.4的磷酸缓冲液冲洗三次，再用1%的锇酸固定2h，经过10-100%乙醇梯度脱水，之后在样品喷金，处理完成后在日立S-3400N扫描电子显微镜(HitachiS-3000N,Tokyo,Japan)下观察豌豆、玉米下表皮叶片气孔特征。

利用STM图像对气孔性状进行检测，每个处理的检测面积≥30个。在每个显微镜下(0.129mm2)测量气孔密度(SD)、表皮细胞(PC)、气孔面积(SA)、气孔长度(SL)和气孔宽度(SW)。

气孔细胞和铺装细胞的密度以平均每mm2数量表示。与SEM前期处理相同，经锇酸和乙醇逐级脱水后的样品用Epon812环氧树脂进行包埋后待用。

固定后的样品包埋块采用Leica半薄切片机制作约为5μm厚度的切片，然后经甲苯胺蓝染色后于荧光倒置显微镜下观察切片的完整性，采用其自带的成像系统获取不同放大倍数下的样片。

经检验半薄切片合格后，再转入装有钻石刀的Leica超薄切片机上切取厚度约为70nm的超薄切片，获取的超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后放置于JEM-1230日立透射电镜下观察，并用GanTan_CCD成像系统进行拍照。

玉米叶绿体性状包括叶绿体类囊体膜组织和每个颗粒类囊体的数量等，豌豆叶绿体性状包括叶绿体类囊体膜组织和每个颗粒类囊体的数量以及叶绿体内淀粉粒数目等，并通过电子显微图进行评估和记录。使用ImageJ软件从图像中提取解剖数据。