糯玉米生长周期短，多次种植指数高。然而，早春、晚秋和冬季种植后，易受低温（LT）影响，降低了出苗率和产量。因此，分析糯玉米在LT胁迫下的响应机制具有重要意义。

玉米根据种子中胚乳的淀粉成分可分为三种类型，即普通玉米，糯玉米和甜玉米。糯玉米是玉米突变后人工培育的，受到许多消费者的青睐。因其营养丰富、风味独特而具有很高的价值。玉米是最重要的嗜热作物之一，易受低温（LT）影响。由于中国早春气温不稳定，作物在播种后经常受到突然的LT影响。LT对作物生长、生产力和质量等有巨大影响。

种子萌发的过程是从吸水到下胚轴延伸的一系列生物变化。玉米种子在发芽过程中受到一系列因素的影响，温度是影响种子萌发的重要外部条件之一。LT是影响植物生长、发育和空间分布的主要非生物胁迫之一，往往会降低和延缓种子的发芽率，甚至导致发芽失败。

为了抵抗LT胁迫，植物已经开发出许多方法来平衡胁迫引起的损伤效应，例如增加脯氨酸的含量，增加解毒物质或酶的活性。植物在被LT诱导后，可以通过合成抗氧化剂、增加细胞内渗透保护物质、适应物理结构来激活防御机制，以恢复植物体内新陈代谢和物质的平衡。

植物内源性激素在种子萌发中起着至关重要的作用。赤霉素（GA）是一种重要的调节激素，可以打破种子休眠并促进种子萌发。活性氧（ROS）可诱导GA合成相关基因的表达，从而促进种子萌发。

脱落酸（ABA）的积累将对种子萌发产生显著的抑制作用。在LT胁迫下，种子中积累的ABA可以抑制ROS的产生和抗坏血酸（ASC）的积累，从而抑制水稻种子的发芽。ABA与GA之间存在拮抗作用，可共同调节种子的发芽和休眠。同时，GA可以降低ABA的含量，促进种子的发芽。ABA可抑制种子萌发，阻碍GA的促进。

细胞膜是冷冻损伤和冷驯化的主要部位。膜流动性对于维持膜蛋白和膜本身的功能活性非常重要，并且直接受温度影响。研究表明，细胞膜的损伤主要是由LT作用下脂肪酸不饱和和脂质过氧化引起的。

脂质过氧化引起的丙二醛（MDA）含量越高，植物的抗寒性就越差。因此，当植物受到LT胁迫时，脂肪酸脱氢酶可以调节脂肪酸不饱和度，增加膜流动性，从而提高植物的耐寒性。同时，脂质是细胞膜的重要组成部分，为植物种子发芽和幼苗生长提供能量。可溶性糖作为膜脂质的组合，对维持细胞膜的稳定性有一定的作用。

种子中有大量的基因可以被LT诱导，并能快速产生应激蛋白来抵抗LT损伤。例如，细胞色素P450（P450s）参与油菜素内酯的生物合成，油菜素内酯可增加幼苗的耐寒性和抗逆性。

BURP家族基因对适应不利和多变环境的植物有积极作用，例如，水稻中的BURP结构域蛋白（OsBURP16）可以降低果胶含量和细胞粘附，同时增加对生物胁迫的不敏感性。转录因子可以通过识别部分启动子功能元件激活靶基因的表达，引起LT相关代谢途径的变化。

研究表明，转录因子包括AP2 / ERF，NAC，WRKY，MYB，bZIP和ZFP等。其在特异性结合靶基因的顺式作用元件中发挥作用，从而调节下游基因响应LT信号的表达。此外，植物中LT相关基因（如脱水响应蛋白、热休克蛋白70、乙烯反应转录因子、冷调节413质膜蛋白和LT诱导蛋白）的下调对于适应LT至关重要。

蛋白磷酸酶2Cs（PP2Cs）是蛋白磷酸酶的一个亚家族，广泛参与应激信号的传递。研究表明，ZmPP2C2基因在玉米中的过表达可以通过激活抗氧化系统并减少H2O2在细胞中，AtPP2Cs的转录水平由LT应激诱导。

植物对LT胁迫的响应是多个基因表达的共同结果，涉及多个基因的表达，具有复杂的调控网络。了解与LT反应相关的基因的作用和功能将有助于提高植物的耐寒性。过去，人们已经意识到玉米的耐寒性存在基因型差异，对其耐寒机制进行了大量研究。然而，关于种子萌发过程中LT耐受性的遗传机制的研究较少。

本研究以糯玉米自交系N28和N67为材料，测定LT处理下糯玉米种子萌发过程中的表型和生理生化物质。同时，利用转录组测序和代谢组学技术发现了关键的候选基因，为培育具有LT耐受性的新品种奠定了理论基础。

实验材料N28和N67分别在25 °C的NT和15 °C的LT下萌发。萌发3 d后，N28和N67在NT的芽长无显著差异，但在LT处差异显著。NT条件下28个自交系种子萌发率和能量正常，而LT条件下种子萌发率和能量显著下降。结果表明，N67和N1的耐寒性存在显著差异。

为分析LT萌发下N28和N67的表型差异，检测了NT和LT条件下N28和N67的萌发率（GR）、萌发能（GE）、萌发指数（GI）、活力指数（VI）、根长（RL）、芽长（BL）、鲜重（FW）和干重（DW）等指标。

这些指标通过方差分析进行分析。如表所示，NT条件下N28和N67的表型指标无显著差异，而LT条件下差异显著。在LT下，N28的指数显著高于N67，如GR、VI、BL、FW和DW，以及GE、GI和RL。上述结果表明，LT抑制种子萌发，N28的耐寒性显著大于N67。

植物细胞会经历一系列的变化，产生各种物质，用于抵抗或适应逆境，从而在逆境应激下维持正常的生理功能。N28和N67分别在15和25 °C萌发，萌发0、24、48、72和96 h后取样。

测定了LT胁迫下N28和N67在不同时间的电子电导率（EC）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（POD）、脯氨酸（PRO）和可溶性糖（SS）含量的变化。随着萌发时间的延长，所有生理指标均呈上升趋势。

在LT胁迫下，N28和N67的SOD和CAT差异无统计学意义;LT胁迫下48 h后可溶性糖（SS）和EC含量差异显著;LT胁迫下72 h后POD和PRO含量差异显著;LT胁迫下24和48 h后MDA含量差异显著。研究发现，在LT胁迫下，N28比N67积累了更多的保护物质，这可能是N28比N67更耐寒的原因。

本研究通过对148个样本的转录组测序分析获得09.18 Gb的清洁数据，每个样本的清洁数据大于6Gb。为了保证分析质量，对原始读数进行过滤，以获得高质量的干净读数。我们总共得到 9.9 × 108高质量干净读取。

通过HISAT73软件将高质量的清洁读数映射到玉米B2参考基因组。本研究共鉴定出37，870个基因，检出10，423个新基因。这些新发现的基因仍需要进一步研究，以探索它们在糯玉米中的功能。为了真实反映转录本的表达水平，需要对每个样本中的映射读段数和转录本长度进行归一化。FPKM用作衡量转录本或基因表达水平的指标。

基因表达受环境影响，并随时间变化。分析了LT萌发下N28和N67的DEGs。结果如表2所示。与各非萌发对照相比，LT萌发下N9265和N7948分别有6752和6487 DEGs上调，28和67 DEGs上调。LT萌发下N5918和N28之间有67个DEGs，其中上调3261个，下调DEGs为2657个。这些结果还表明，在LT胁迫下，N28和N67之间的基因表达存在显著差异。

MC28和MC67是指N28和N67的非发芽对照样品;ML28和ML67分别指在LT萌发的N28和N67样品。向下代表向下调节。向上代表向上监管。

为了验证RNA-seq数据，我们选择了20个候选DEG进行qRT-PCR。这些DEG参与植物激素信号转导，苯丙烷生物合成，类黄酮生物合成，氨基酸合成，过氧化氢分解和脂质代谢。它还包括一些膜蛋白基因和转录因子基因。

这些DEG包括LT处理的样品和非萌发对照之间的上调和下调基因。qRT-PCR分析的所有候选基因的表达谱与RNA-seq获得的表达谱一致。表明RNA-seq结果是可靠的。

基因本体（GO）知识库是世界上最大的基因功能信息来源。GO分析是大规模分子生物学和遗传学实验计算分析的基础。我们在N16和N017中鉴定了14，435和28，67个DEGs，与LT萌发下的非萌发对照组进行了比较。

我们分析了这些DEG，以了解它们的调节机制。这些DEGs主要分为三类GO：细胞成分，分子功能和生物过程。这些 DEG 被注释到 GO 数据库中，用于功能注释和富集分析。

GO术语“单羧酸生物合成过程”、“水解酶活性、水解O-糖基化合物”、“次级活性跨膜转运蛋白活性”和“细胞对生长素刺激的反应”在N28基因集中富集最高，GO术语“水解酶活性，水解O-糖基化合物”、“单羧酸生物合成过程”、“细胞多糖代谢过程”和“对氮化合物的反应”是其中富集度最高的N67中的基因集。

N28和N67在LT萌发下可能具有共同的调控机制，如“单羧酸生物合成过程”和“水解酶活性，水解O-糖基化合物”。在N28中，大多数DEG被归类为“单羧酸生物合成过程”，但大多数DEG被归类为N67中的“水解酶活性，水解O-糖基化合物”。

LT萌发下N5918和N67之间有28个DEGs。GO术语“氧化还原酶活性，作用于配对供体，掺入或还原分子氧”，“微管细胞骨架”，“水解酶活性，水解O-糖基化合物”和“药物分解代谢过程”是高度富集的。 N67和N28之间高度丰富的GO项可能导致电阻差异，但仍需进一步研究以阐明电阻差异的机制。

KEGG将基因组信息和高级功能信息有机结合，对基因组测序和其他高通量测序产生的大数据进行系统分析。与各非萌发对照相比，采用KEGG在LT萌发下分析N28和N67中鉴定的DEGs。

“代谢途径”、“次生代谢产物的生物合成”、“植物激素信号转导”和“苯丙类生物合成”是N28中富集度最高的不同基因，“代谢途径”、“次生代谢产物的生物合成”、“植物激素信号转导”和“植物-病原体相互作用”是N67中富集度最高的不同基因。

“次生代谢物的生物合成”和“植物激素信号转导”等相同的途径可能极大地有助于抵抗N28和N67的逆境。“MAPK信号通路-植物”和“淀粉和蔗糖代谢”也富集在N28和N67中。据报道，不同的蛋白激酶家族（如MAPKs）被渗透胁迫激活。这些蛋白激酶和蔗糖代谢可能在糯玉米对LT胁迫的反应中起至关重要的作用。

“代谢途径”、“次生代谢物的生物合成”、“苯丙类生物合成”和“半乳糖代谢”在ML67_VS_ML28中富集最显著（图）。6）. N67和N28中“半乳糖代谢”的富集度不高，但N28中的富集度高于N67（图）。6）. 这些途径可能是N28对LT的抵抗力高于N67的原因之一。

当植物面临恶劣的生活环境时，会以多种方式调节机体的生理代谢活动，TFs的调节是一种重要的调节方法。分子和遗传研究发现，许多TFs在调节基因表达方面很重要，以在植物受到逆境压力时增强植物抗性。本研究在LT萌发下在N447和N28之间检测到67个不同表达的TFs，它们被归类为65个科，TF家族的前15个如图所示。7. 其中，bHLH、AP2、MYB、NAC和bZIP占TF总数的35.12%。

转录和代谢组学的结合分析可以帮助我们系统、全面地研究生物分子的功能和调控机制，最终实现对生物变化趋势和方向的全面认识。为了理解差异代谢产物与差异基因的相关性，我们选取Pearson相关系数大于0.8的结果对差异基因和差异代谢产物进行相关性分析，并制作了聚类热图。

我们在对照和冷胁迫N2826样品之间鉴定了与9种代谢物相关的28个差异表达基因。对于N67，有1778个与7种代谢物相关的差异表达基因。其中，黄酮类化合物、木脂素和香豆素仅存在于N28中，这些代谢产物在LT萌发下可能赋予N28更高的耐寒性。

低温胁迫会影响植株的一系列形态和生理变化，延缓玉米种子萌发，对其生长、产量和品质影响很大。LT胁迫会增加活性氧（ROS）的积累，植物中的ROS清除酶主要是抗氧化酶，如SOD、POD和CAT等。

此外，可以增加植物中脯氨酸（PRO）和可溶性糖（SS）的含量，以提高对LT胁迫的抵抗力。本研究显示，N28中SOD、POD、CAT、PRO和SS的含量显著高于N67。电导率（EC）和MDA的含量可以反映膜渗透率的指标，可用于衡量植物的耐寒程度。

EC和MDA越高，植物受低温的损害就越严重。在我们的研究中，N67中的EC和MDA含量高于N28。因此，N28和N67在低温下的抗性不同可能是由于抗氧化酶的活性不同，渗透保护剂的含量不同。

植物激素对植物的生长、发育和新陈代谢很重要。先前的研究表明，植物激素在帮助植物适应不利环境条件方面起着关键作用，并参与植物对LT胁迫的反应。研究表明，低温胁迫会影响植物的生长发育。

4 °CLT处理可增加水稻内源性吲哚乙酸（IAA）含量，冷胁迫强烈诱导OsYUCCA2、OsYUCCA3、OsYUCCA6和OsYUCCA7的转录水平。 本研究显示，植物信号转导通路N28和N67均显著富集，冷胁迫下生长素、赤霉素、乙烯、水杨酸和脱落酸等多个相关基因均受到调控。

研究表明，LT胁迫可以诱导植物中乙烯含量的增加。乙烯作为信号分子，可以促进防冻蛋白的合成，提高冬黑麦的耐寒性。在我们的研究中也发现了相同的结果。与N67相比，乙烯合成负调节因子ETR在N28中的表达水平显著下调，这可能与种子中乙烯合成的改善有关。