编者说
由于测序技术的进步，微生物群与寄主植物之间的相互作用最近受到了广泛关注，研究者可以参考本文内容从多个维度探讨各类微生物在生命过程中所发挥的潜在作用。除了细菌多样性外，真菌多样性也是测序界的小可爱，两组学的研究效果1+1>2。
发表期刊：Frontiers in Plant Science
影响因子：4.1
研究内容：不同品种棉花根际和根内细菌、真菌群落的关联情况
关键词：棉花，抗萎蔫，根际微生物，根内生菌
发表时间：2019.12
实验设计
为评估根际或根际微生物群落和特定微生物群是否与栽培品种的抗病性有关，因此在中国科学院棉花研究所(安阳)进行了田间试验。试验场地土壤为形成层土壤，采用完全随机区组设计，共3个区。实验共计9个品种，包括:NXC1208, SNM9, ZM9421, LMY21，GXM25、BM16、JK10、KM50和JM11。每个区由9块土地组成，每块土地长5米，两行(两行之间长0.8米)，相邻块土地之间相隔0.8米。每块土地在种植前采集6个土芯，并栽种单个样本，用于评估枯萎病接种水平。2016年4月播种，行内距植株25 - 30 cm。在8月下旬(结铃期)，播种后约16周，所有植株的枯萎严重程度按0 ~ 4分进行记录：0 =无症状，1 ≤33%，33%≤2 ≤66%，66%≤2 ≤99%，4 = 100%叶枯病症状，然后计算每个小区的总体疾病指数(DI)。
根际样品采集：每块土地随机选择三株植株用铁锹小心地从土壤中移出，根系首先大力摇动，去除松散的粘着的土壤颗粒，用无菌剪刀将植株细根剪成约2厘米长的小片，根清洗悬浮液用无菌纱布过滤并反复离心弃上清最终获得根际样品。
根内组织样品采集：植物清洗后，干净的根转移到一个新的瓶子中，表面消毒。用无菌剪子将根切成大约1厘米长的块状，放在在无菌聚乙烯袋中，用软头锤均匀化。在缓冲液中再次摇晃残留物分离微生物。为收集根端微生物，洗涤悬浮液用无菌纱布过滤，反复离心弃上清，最终获得根内组织样品。
取根际土壤样品、根内组织样品进行DNA提取，然后分别16S和ITS扩增子测序分析。
实验方法
16S rDNA，ITS5 ，ITS2
研究背景
植物微生物群落被称为寄主的第二基因组，由不同的微生物种类组成。有益的土壤微生物有助于抗病、耐旱和促进植物生长，最近的证据表明，植物基因型的变异也会对根际微生物群落产生重大影响，特定的植物基因型可能会聚集有益的微生物来帮助它们抵御病原体。
棉花是世界范围内重要的经济作物，黄萎病由土壤中真菌病原体黄萎病杆菌引起，是棉花的主要病害，不同品种的棉花对黄萎病的敏感性不同，可以分为易感病品种和抗性品种，目前还不清楚抗病性是否与根际微生物和根内生菌有关。
文章研究了不同棉花品种与黄萎病菌根际和根际微生物群落的关系。对9个棉花品种的土壤样品进行了黄萎病微菌核密度测定，对植物的病害发展进行了评估，然后使用扩增子测序来分析细菌和真菌群落与不同枯萎病严重程度，不同品种，不同接种密度的差异。
研究结果
植物抗病研究
田间试验中平均枯萎病指数在7.9 (NXC1208)至60.6 (JM11)，温室试验中为19.8 (NXC1208)到36.9 (JM11)。3个栽培品种(NXC1208、SNM9、ZM9421)在田间试验中枯萎病指数极低，属于抗病品种;其他6个品种(LMY21, GXM25, BM16, JK10, KM50，和JM11)为黄萎病易感品种。
9个品种的田间试验中枯萎病疫苗CFU值（每克干土中含有的微生物群落总数）和病害指数均为3个重复小区的平均值，通过3次重复试验（n=27），得到棉花栽培试验的萎蔫病防治指标。发现田间试验中差异大部分是由感病品种和抗病品种之间的差异造成的。9个品种在温室试验中平均枯萎病指数的实际差异要比田间试验小得多，在温室试验中品种差异占总变异性的大多数也是由于感病品种和抗病品种之间的差异造成的。
表1
图1 9个棉花品种的枯萎病菌CFU值和病害指数
物种分类信息
使用16S和ITS测序，结果发现根际细菌比内生细菌更多样，几乎所有的内生细菌序列都属于变形菌门(99.7%)，而根际细菌门是变形菌门(74.5%)、酸菌门(11.4%)和厚壁菌门(9.6%) ；三个最丰富的内生真菌门是子囊菌门(76.9%)，担子菌(4.1%)，接合菌(1.5%)，根际样品对应的值为59.6%、8.4%和2.6%。
图2a内生菌和根际菌的稀释曲线
图2b 门水平上细菌、真菌的丰度柱状图
Alpha多样性研究
研究发现根际样本中的细菌OTUs数量要比根内组织样本中观察到的细菌OTUs数量大得多，抗病品种的内生菌OTUs的数量要比易感品种的内生菌OTUs的数量要高得多。真菌上来看根际样品真菌种群比根内真菌种群更多样化，但差异小于细菌，而且抗病品种和易感品种的alpha多样性指数均无显著差异（图3）。
图3a 9个棉花品种根际细菌的Alpha多样性，3b 9个棉花品种内生细菌的Alpha多样性，3c 9个棉花品种内生真菌的Alpha多样性，3d 9个棉花品种根际真菌的Alpha多样性
Beta多样性研究
UniFrac和PCA分析结果相似，作者仅展示了PCA分析结果（图4）。
图4 棉花细菌、真菌PCA图
差异分析
然后对棉花抗性和感病品种间细菌真菌相对丰度进行了比较（表2）。使用DESeq2分析在抗病品种与感病品种之间的相对丰度存在显著差异的内生菌和根际菌，绘制丰度与差异倍数散点图（图5）和相对丰度差异树图（图6）。
表2
图5 相对丰度差异散点图
（baseMean是每个OTU的平均丰度，log2FoldChange是抗病品种和感病品种之间丰度差异对数）
图6 图6 a棉花抗病品种与易感病品种内生细菌相对丰度差异的树图（颜色表明抗病和易感品种差异倍数，节点的大小代表了在物种丰度），6 b棉花抗病品种与易感病品种根际细菌相对丰度的差异的树图，6c棉花抗病品种与易感病品种根内生真菌相对丰度差异的树图，6 d棉花抗病品种与易感病品种根际真菌相对丰度差异的树图。
总结
本研究表明，植物基因型与植物相关的微生物群落的形成有关，根际微生物群和根内生菌的特定类群可能与棉花对黄萎病的抗性有关，而且这种关系在细菌比真菌更明显；抗病品种和易感病品种间微生物的相对丰度存在差异，根际有益微生物有助于减少萎蔫病的发生。
参考文献
Feng Wei , et al. Cultivar-Dependent Variation of the Cotton Rhizosphere and Endosphere
Microbiome Under Field Conditions .Frontiers in Plant Science ,2019.doi:10.3389/fpls.2019.01659 返回搜狐，查看更多
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