植物细胞全能性和再生
细胞全能性和多能性是植物再生的细胞学基础. 2005年, Science杂志公布了125个最具挑战性的科学问题, 其中植物细胞全能性被列为最重要的25个科学问题之一. 植物体细胞的命运如何在激素作用下进行重编程, 通过细胞分裂和分化发育成为一个独立的植株或器官是建立植物高效再生方法的理论基础. 植物再生技术的发展和基因组编辑技术的应用将引领作物分子育种技术的变革, 培育出更多高产、多抗、环境友好的未来作物, 助推世界农业的可持续发展.
今天给大家推荐发表在中国科学生命科学的重磅综述文章《植物细胞全能性和再生》，该综述论文由许智宏 , 张宪省, 苏英华, 胡玉欣 , 徐麟 以及王佳伟老师合作完成。本文回顾了新中国成立70年以来我国在植物组织培养和细胞全能性领域的研究成果和发展历程, 通过总结国内外最新的研究进展提出本领域亟需回答的重要科学问题以及学科将来的发展方向.
引言
再生(regeneration)是指生物体的组织或器官在受损或胁迫后自我修复或替换的过程. 在动物中, 如水螅、涡虫、棘皮动物(海星、海百合)等物种将其身体部分切割后, 都能在伤口处再生出完整的形态. 植物也具有强大的再生能力, 例如, 园艺上广为应用的扦插繁殖、很多植物地下根切段上和离体叶柄基部芽的再生; 在树冠修剪后, 树木受伤的枝条可以再生不定芽, 发育为新的树冠等.
1 植物细胞全能性的发现
生物体再生的细胞学基础在于细胞全能性(totipotency)和多能性(pluripotency). 1902年, 德国著名植物生理学家Haberlandt[1]根据细胞学说, 大胆地提出了“细胞全能性”概念. 他预测, 植物体细胞具有可以在体外培养后脱分化并发育成完整植株的能力, 为植物细胞全能性的诱导研究奠定了理论基础. Haberlandt将高等植物的各类组织细胞在培养基上进行离体培养, 最终发现, 有些细胞能够增大, 却始终没有看到细胞分裂和增殖.
1939年, White和Nobécourt首次观察到植物组织培养过程中芽和根的发生. 3年后, Gautheret[2,3]在组织培养过程中得到了榆树的幼芽和菊苣的幼苗. 1947年, Levine[4]发现, 在胡萝卜组织培养中移除生长素可以诱导芽的产生. 在White实验的基础上, Skoog[5]发现, 当烟草组织在固体培养基上培养时会产生不规则的生长, 而当烟草组织被浸没在液体培养基内时会诱导芽的发生. 随后, Skoog和Tsui(崔澂)[6]一起发现腺嘌呤(adenine)可以促进烟草茎外植体的细胞分裂, 芽和根的发生是由培养基中腺嘌呤和生长素的平衡决定的. 1955年, 激动素(kinetin, 一种细胞分裂素的类似物)被发现. 1957年, Skoog和Miller[7]在此基础上发现, 激动素可以有效地促进外植体的细胞分裂和芽再生. 尤为重要的是, 他们发现, 高激动素/生长素比例诱导芽的发生而低激动素/生长素比例促进根的发生. 这一发现奠定了植物组织培养中再生和细胞工程的基础, 揭开了激素调控植物器官再生的秘密面纱.
为了证实Haberlandt提出的植物细胞全能性假说, 需要证明单个植物细胞可以分裂, 同时这个细胞可以通过细胞分裂与分化形成一个完整的植株. 1954年, Muir等人[8]利用万寿菊愈伤组织建立了植物细胞悬浮系. 他们通过愈伤组织哺育方法(nurse culture method)成功地观察到单个细胞可以分裂形成小的细胞团. 1958年, Steward等人[9]将胡萝卜根韧皮部的细胞进行离体培养, 发现这些细胞失去已分化细胞的结构特征并发生反复的细胞分裂, 最终形成胚胎并发育成具有根、茎、叶等器官的完整植株. 同年, 德国科学家Reinert[10,11]也获得了类似的研究结果. 此后科学家们经过50余年的不断实验, 至今植物细胞的全能性已经得到充分验证. 然而植物体细胞如何启动重编程重新获得细胞分裂的能力, 进而表达全能性的分子机理目前仍不清楚. 2005年, Science杂志在庆祝其创刊125周年之际, 公布了125个最具挑战性的科学问题. 其中植物细胞全能性被列为最重要的25个科学问题之一[12].
2 植物细胞全能性的基本概念
随着分子生物学和细胞生物学理论的发展, 细胞的多能性、全能性和再生已经逐渐从一个自然现象发展为再生医学和植物细胞工程的理论基础. 在动物领域, 体细胞可以在多个转录因子的诱导下重编程, 成为具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的干细胞(stem cell), 进而发育形成新的器官和组织; 在植物领域, 离体培养的植物组织和细胞也可以在植物激素的诱导下再生出新的器官或一棵完整的植株.
高等植物的器官起源于茎端分生组织(shoot apical meristem, SAM)、根端分生组织(root apical meristem, RAM)和侧生分生组织(lateral meristem). 存在于分生组织的干细胞既可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小, 同时又可以进一步分化成为各种不同组织或者器官的细胞, 从而构成机体各种复杂的组织器官. 因此, 它们是高等植物组织器官产生的来源, 是植物发育无限性的细胞学基础[13]. 由于分生组织干细胞受到来源于周围已分化成组织形成的微环境信号的调控, 它们只能分化各种器官而不能形成完整植株, 因此被认为是具有多能性的植物干细胞[14]. 除植株的分生组织干细胞能够表现植物细胞的多能性而分化产生器官外, 在胁迫、创伤或激素处理等离体培养条件下也能诱导产生新的植物组织或器官, 实现植物细胞多能性的离体诱导[15].
植物细胞在一定条件下也能表现出细胞全能性, 即单个植物细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力. 在高等植物的有性生殖过程中, 两个单倍体的配子(卵细胞和精细胞)融合后形成二倍体的单细胞受精卵, 并继续发育成胚胎, 最终形成完整的新植株. 因此, 单细胞受精卵具有发育成完整植株的能力, 是植物中典型的全能性细胞. 在自然界中, 许多特殊的植物能够在卵细胞未受精的情况下产生胚胎, 即无融合生殖现象. 在无融合生殖植物中, 胚胎可以由胚珠孢子体组织或未退化的配子体细胞直接发育而成[16]. 还有一些植物, 如落地生根等可以在叶子的边缘通过器官发生和体胚再生的协同过程形成不定胚, 然后通过胚胎发生完成植株发育[17]. 除此之外, 植株上大多数组织和器官的体细胞只能表现一定的形态和生理功能, 这是因为它们受控于其所在植株部位的特定生长发育环境. 而当它们一旦脱离植株而处在离体状态、失去特定发育环境条件的制约, 在一定的条件下, 如胁迫、创伤或激素等外界条件刺激, 植物体细胞就会进入重编程过程, 进而表现出细胞全能性.
高等植物的再生可分为以下三种: 组织修复(tissue repair); 器官从头再生, 包括根从头再生(de novo root regeneration)和芽从头再生(de novo shoot regeneration); 体细胞胚再生(somatic embryogenesis)(图1). 组织修复是指组织或器官在损伤或缺失后, 可以修复或重新生长出能够替代原来组织器官行使功能的结构. 根和芽的从头再生是指受伤或离体的植物组织长出不定根或不定芽的过程[18]. 器官从头再生是植物再生的重要方式, 与体细胞胚再生不同, 植物器官从头再生的过程仅需诱导外植体(explant, 即离体组织或器官)形成SAM和RAM, 无需经过类似胚胎发育的过程. 体细胞胚再生是指已分化的体细胞在一定条件下脱分化获得分生能力, 经过类似胚胎发育的过程形成完整植株[19].
3 我国在植物组织培养和细胞全能性领域的历史贡献
20世纪30~40年代, 李继侗、罗宗洛、崔澂和罗士韦等教授开展了一系列植物组织培养工作. 1934年, 李继侗和沈同[20]发表的“银杏胚在体外的发生”“泛酸对酵母生长及银杏胚根在人工培养基中生长的效应”等文章是我国植物组织培养和器官培养的开端. 这些文章首次报道了银杏胚乳中存在促进胚胎在体外培养基上生长发育的未知物质. 受此研究成果的启发, van Overbeek等人[21]在1941年发现, 椰奶(液态的胚乳)可以促进幼嫩曼陀罗胚胎的生长和发育, 并最终奠定了细胞激动素的发现基础. 1942年, 罗宗洛和罗士韦[22]研究了氮源对玉米离体根尖生长的影响. 1943年, 罗士韦和王伏雄[23]在世界上首次实现了裸子植物的胚胎体外培养. 此后, 罗士韦又建立了植物茎尖离体培养技术, 成功地利用该技术使菟丝子在试管中长成植株并开花, 开创性地将组织培养技术应用于实验研究.
20世纪50~60年代, 国内开展植物组织和细胞培养工作的研究机构不多, 科研人员主要从事一些基础性研究并试图与实际应用相结合. 例如, 中国科学院上海植物生理研究所罗士韦实验室开展了植物激素与愈伤组织生长以及人参等药用植物组织培养的工作; 中国科学院植物研究所王伏雄实验室系统性地开展了植物幼胚培养工作; 北京大学曹宗巽实验室通过建立黄瓜体外茎尖培养的方法, 研究乙烯等激素对雌雄花性别决定的影响; 北京大学李正理实验室利用胚培养研究胚根顶端纵切对根形态发生的影响. 此外, 还有一些育种机构尝试利用胚胎挽救(embryo rescue)方法进行远缘杂交以获得杂种, 并开展马铃薯脱毒苗的前期研究工作. 令人遗憾的是, 植物组织培养工作在当时特殊的历史时期下, 时断时续.
1964年, Guha和Maheshwari[24]建立了毛叶曼陀罗的花药培养体系, 并观察到类似胚胎状结构的产生. 在此基础上, 他们于1966年成功获得了毛叶曼陀罗单倍体植株[25]. 这两项工作为今后的花药培养和单倍体育种工作奠定了基础. 1967年, Bourgin和Nitsch[26]利用类似的体系实现了烟草的单倍体诱导. 1968年, Niizeke和Oono[27]首次实现了通过花粉培养体系诱导形成单倍体谷类作物. 由于单倍体可以用于育种, 因此这一方面的工作在“文化大革命”这一特殊时期下得到蓬勃发展. 中国科学院遗传研究所、中国科学院植物研究所、中国农业科学研究院等单位在20世纪70年代早期便开展了相关研究, 最多时, 国内有数百家单位开展类似的工作, 形成了单倍体育种的研究热潮. 我国学者对水稻、小麦、玉米等禾谷类作物, 油菜和多种蔬莱的花药培养做了系统的工作, 并培育出一系列花培品种和品系. 值得一提的是, 中国科学院植物研究所朱至清和孙敬三等人[28,29]发现, 低氨和过滤除菌的葡萄糖对水稻花粉的愈伤组织形成和体细胞胚发生具有促进作用, 并在此基础上成功研制了适合小麦花药培养的N6培养基, 这一培养基现已广泛用于禾谷类作物组织培养中.
1960年, 英国诺丁汉大学科学家Cocking[30]首次利用纤维素酶酶解的方法获得了番茄幼苗根的原生质体. 此后10年, 商业化的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶也逐渐发展成熟. 20世纪70年代中后期, 中国科学院植物研究所、中国科学院遗传研究所、中国科学院上海植物生理研究所、兰州大学、山东大学等科研院所和高校开始开展植物原生质体培养和体细胞杂交工作. 除了摸索与建立原生质体培养体系外, 还希望以原生质体为受体导入外源DNA/基因, 或通过体细胞杂交, 获得一些重要农作物的杂种. 在这一方面, 我国科学家做出了一系列出色的工作. 一批重要农作物, 包括水稻、小麦、玉米、高粱、谷子等禾谷类作物, 重要豆科植物大豆、花生和蚕豆, 以及多种果树和林木, 通过原生质体培养获得了再生植株[31,32].
利用植物茎尖离体培养(shoot tip culture)方法生产脱毒苗也是20世纪70年代我国植物组织培养和细